3 hiệu quả bảo quản tế bào gốc tủy răng của dung dịch chuyên chở

Mục tiêu: Nghiên cứu nhằm đánh giá hiệu quả bảo quản tế bào gốc (TBG) tủy răng bằng dung dịch chuyên

chở mới, không đắt tiền, pha chế dễ dàng với các thành phần phổ biến ở Việt Nam.

Vật liệu và phương pháp nghiên cứu: Dung dịch chuyên chở được pha bằng cách hòa tan 3 ống

gentamycin 80mg/2ml trong 500ml dung dịch nước muối sinh lý. Nghiên cứu thử nghiệm được thực hiện trên

43 răng khôn nguyên vẹn thu thập từ các bệnh nhân 18 – 35 tuổi đến nhổ răng tại Khoa Răng Hàm Mặt. Răng

được loại bỏ mô mềm, tạo rãnh sâu 2mm trên thân – chân răng và bảo quản bằng dung dịch chuyên chở trong 6

giờ, 9 giờ, 12 giờ ở điều kiện 4°C. Đánh giá mô tủy nhiễm trùng khi môi trường nuôi cấy vẩn đục sau 3 – 5 ngày

nuôi cấy và mẫu mô tủy xem như đã chết khi không có tế bào phát triển sau 2 tuần nuôi cấy.

Kết quả: Trong 43 răng khôn, số lượng răng được bảo quản trong 6 giờ, 9 giờ và 12 giờ lần lượt là 14 răng,

16 răng và 13 răng. Có 1 mẫu trong nhóm 12 giờ bị nhiễm khuẩn sau 5 ngày nuôi cấy. Tỉ lệ mẫu không nhiễm

đạt 100% ở nhóm 6 giờ và 9 giờ; 92,3% ở nhóm 12 giờ. Tỉ lệ mẫu nuôi cấy cho tế bào bám dính là 92,9% đối với

nhóm 6 giờ; 75,0% đối với nhóm 9 giờ và 53,8% đối với nhóm 12 giờ. Kết quả flow‐cytometry cho thấy quần thể

tế bào P4 được phân lập dương tính cao (>99,5%) với các marker của TBG trung mô và biểu hiện khá thấp (7,5%

‐ 10,6%) với các marker tế bào tạo máu.

pdf6 trang | Chia sẻ: tieuaka001 | Ngày: 29/09/2020 | Lượt xem: 97 | Lượt tải: 0download
Nội dung tài liệu 3 hiệu quả bảo quản tế bào gốc tủy răng của dung dịch chuyên chở, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Chuyên Đề Mắt – Tai Mũi Họng – Răng Hàm Mặt 282 3 HIỆU QUẢ BẢO QUẢN TẾ BÀO GỐC TỦY RĂNG CỦA DUNG DỊCH  CHUYÊN CHỞ  Lê Hoàng Sơn*, Ngô Thị Quỳnh Lan*, Trần Lê Bảo Hà**  TÓM TẮT  Mục tiêu: Nghiên cứu nhằm đánh giá hiệu quả bảo quản tế bào gốc (TBG) tủy răng bằng dung dịch chuyên  chở mới, không đắt tiền, pha chế dễ dàng với các thành phần phổ biến ở Việt Nam.  Vật  liệu  và  phương  pháp  nghiên  cứu: Dung  dịch  chuyên  chở  được  pha  bằng  cách  hòa  tan  3  ống  gentamycin 80mg/2ml trong 500ml dung dịch nước muối sinh lý. Nghiên cứu thử nghiệm được thực hiện trên  43 răng khôn nguyên vẹn thu thập từ các bệnh nhân 18 – 35 tuổi đến nhổ răng tại Khoa Răng Hàm Mặt. Răng  được loại bỏ mô mềm, tạo rãnh sâu 2mm trên thân – chân răng và bảo quản bằng dung dịch chuyên chở trong 6  giờ, 9 giờ, 12 giờ ở điều kiện 4°C. Đánh giá mô tủy nhiễm trùng khi môi trường nuôi cấy vẩn đục sau 3 – 5 ngày  nuôi cấy và mẫu mô tủy xem như đã chết khi không có tế bào phát triển sau 2 tuần nuôi cấy.  Kết quả: Trong 43 răng khôn, số lượng răng được bảo quản trong 6 giờ, 9 giờ và 12 giờ lần lượt là 14 răng,  16 răng và 13 răng. Có 1 mẫu trong nhóm 12 giờ bị nhiễm khuẩn sau 5 ngày nuôi cấy. Tỉ lệ mẫu không nhiễm  đạt 100% ở nhóm 6 giờ và 9 giờ; 92,3% ở nhóm 12 giờ. Tỉ lệ mẫu nuôi cấy cho tế bào bám dính là 92,9% đối với  nhóm 6 giờ; 75,0% đối với nhóm 9 giờ và 53,8% đối với nhóm 12 giờ. Kết quả flow‐cytometry cho thấy quần thể  tế bào P4 được phân lập dương tính cao (>99,5%) với các marker của TBG trung mô và biểu hiện khá thấp (7,5%  ‐ 10,6%) với các marker tế bào tạo máu.  Kết luận: Dung dịch chuyên chở đề nghị có thành phần dễ tìm, pha chế đơn giản và không đắt tiền nhưng  vẫn có hiệu quả cao trong việc bảo quản sự sống của TBG tủy răng. Các mẫu tủy răng vẫn có thể cho TBG trung  mô sau 12 giờ bảo quản và hiệu quả bảo quản tương đương với các dung dịch thương mại trong 6 giờ.  Từ khóa: tế bào gốc tủy răng, dung dịch chuyên chở, flow cytometry, tế bào gốc trung mô, marker  ABSTRACT  THE EFFICIENCY OF A NOVEL TRANSPORT SOLUTION IN  PRESERVING DENTAL PULP STEM CELLS  Le Hoang Son, Ngo Thi Quynh Lan, Tran Le Bao Ha   * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 ‐ Supplement of No 1 ‐ 2014: 282 ‐287  Objectives: The purpose  of  this  study  is  that  testing  the  efficiency  of  a  suggested  transport  solution  in  preserving dental pulp stem cells (DPSCs) in 6, 9, and 12 hours after the teeth were extracted.  Materials  and Methods: A new  transport  solution was  fomulated by mixing  three  jars of gentamycin  80mg/2mL (in  liquid  form) with 500ml sterile saline. The solution was poured  into several small vials. Forty‐ three extracted intact human third molars were obtained from Oral Surgical Center at the Faculty of Odonto –  Stomatology. The teeth were divided into three groups: group A (n=14) – stored in 6h, group B (n=16) – stored in  9h and group C  (n=13) –  stored  in 12h. Teeth were  externally  sterilized and DPSCs were  isolated using  the  protocol adapted from Stem Cell laboratory at the University of Sciences.  Results: The percentage of uncontaminated samples was 100% for group A and B, 92.3% for group C. The  * Khoa RHM – Đại học Y Dược TP. HCM ** Khoa Sinh Học – Trường ĐH Khoa Học Tự Nhiên – ĐHQG TP. HCM Thông tin liên hệ: Lê Hoàng Sơn ĐT: 0933688804 Email: sonrhm07@gmail.com  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014  Nghiên cứu Y học Răng Hàm Mặt  283 success rate  for DPSCs  isolation was 92.9%  for group A, 75.0%  for group B and 53.8%  for group C. Three  selected passage 4 DPSCs cultures showed high expression of bone – marrow mesenchymal stem – cell (MSC)  markers (>99.5%) and low expression of specific hematopoietic cells markers (7.5% ‐ 10.6%).  Conclusion: Suggested solution is not expensive, easy to solube with available ingredients, and effective in  preserving DPSCs. The pulp of extracted wisdom teeth still has viable MSCs after 12 hours preservation, and the  effect of transpotation solution is same with commercial ones in 6 hours.  Keywords: dental pulp stem cells, transport solution, flow cytometry, mesenchymal stem cells, marker  ĐẶT VẤN ĐỀ  Tế bào gốc (TBG)  là các tế bào có khả năng  biệt hóa thành nhiều dòng tế bào trưởng thành.  TBG được tìm thấy ở nhiều mô khác nhau như  não,  tủy xương, máu, mạch máu, da, gan, mỡ,  răng, So với các loại TBG khác, TBG tủy răng  có những ưu điểm như dễ thu nhận, không gặp  những trở ngại về pháp  lý và nhân quyền, tỉ  lệ  tăng sinh cao, có khả năng biệt hóa thành nhiều  dạng  tế bào khác nhau khi nuôi cấy  trong môi  trường  thích hợp và  ít gây  đáp  ứng miễn dịch  khi cấy ghép. Kể từ khi được phân  lập và nuôi  cấy thành công vào năm 2000, nhiều báo cáo về  tiềm năng biệt hóa của TBG  tủy răng được các  nhà khoa học  trên khắp  thế giới công bố. Song  song  đó,  bước  đầu,  TBG  tủy  răng  đang  được  ứng dụng  trong việc điều  trị một vài bệnh  liên  quan đến  thần kinh, gan,  tim  trên động vật và  cho kết quả khả quan. Từ những phát hiện về  khả năng  biệt hóa  và  tiềm năng  sử dụng  như  một nguồn vật  liệu  trong y học  tái  tạo, các nhà  khoa học đã nghĩ đến việc bảo quản lạnh chúng.  Hiện nay, trên thế giới có nhiều ngân hàng TBG  răng  thương mại đang hoạt động như Store‐A‐ Tooth  (Lexington,  MA,  Hoa  Kì),  NDPL  (Newton, MA, Hoa Kì),  StemSave  (New York,  Hoa  Kì),  Three  Bracket  (Hiroshima,  Nhật  Bản),  Trong  quy  trình  bảo  quản,  dung  dịch  chuyên chở đóng vai trò rất quan trọng. Nó đảm  bảo cho răng không bị nhiễm các vi sinh vật như  vi khuẩn, vi nấm và duy trì sự sống của TBG tủy  răng. Có  nhiều  dung  dịch  được  sử  dụng  như  DMEM, α – MEM, HBSS, PBS, Tuy nhiên, các  dung dịch này có giá thành cao, khó pha chế và  không phổ biến tại thị trường Việt Nam.  Nhằm  mục  đích  tạo  một  môi  trường  chuyên  chở  có  các  thành  phần  phổ  biến,  dễ  pha chế, không  đắt  tiền và có hiệu quả  trong  việc bảo quản sự  sống của TBG  tủy  răng,  tạo  tiền đề để  thành  lập một ngân hàng TBG  tủy  răng tại Việt Nam, chúng tôi đề nghị một dung  dịch  chuyên  chở mới  có  thành phần  chính  là  nước muối sinh lý và gentamycin. Nghiên cứu  này được  thực hiện với vấn đề quan  tâm sau:  Hiệu  quả  bảo  quản  tế  bào  gốc  tủy  răng  của  dung dịch chuyên chở.  VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU  Mẫu nghiên cứu  43 răng khôn vừa mới nhổ tại bộ môn Phẫu  Thuật Miệng, Khoa Răng Hàm Mặt, Đại học Y  Dược TP. HCM.  Thiết kế nghiên cứu  Nghiên  cứu  trong  phòng  thí  nghiệm  (in  vitro),  răng  được  bảo  quản  trong  dung  dịch  chuyên  chở  ở  điều  kiện  4°C  trong  các  khoảng  thời gian:  (1) Trong 6 giờ.  (2) Trong 9 giờ.  (3) Trong 12 giờ.  Quy trình thực hiện  Chuẩn bị dung dịch chuyên chở  Dung dịch  chuyên  chở  được pha  chế bằng  cách hòa tan 3 ống gentamycin 80mg/2ml trong  500ml  dung  dịch  nước muối  sinh  lý.  Lắc  đều  chai dung dịch trong 2 phút để tạo môi  trường  đồng nhất. Sau đó, chiết ra mỗi ống falcon (dung  tích 15ml) 5ml dung dịch chuyên chở.  Thu thập mẫu răng  Các răng khôn còn nguyên vẹn sau khi nhổ  được  làm sạch phần mô nha chu, bao răng còn  Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Chuyên Đề Mắt – Tai Mũi Họng – Răng Hàm Mặt 284 dính xung quanh. Sau đó, dùng tay khoan siêu  tốc và mũi khoan tròn có đường kính 2mm tạo  một  rãnh  trên  thân – chân  răng. Đưa  răng vào  ống  falcon  có  dung  dịch  chuyên  chở  và  bảo  quản trong đá lạnh ở điều kiện 4°C.  Thu nhận mô tủy răng  Quy trình được thực hiện trong tủ nuôi cấy  sinh học,  tại Phòng  thí nghiệm  nghiên  cứu  và  ứng dụng Tế Bào Gốc, Khoa Sinh Học, Trường  Đại học Khoa Học Tự Nhiên.  Răng  được khử  trùng bằng  cách:  sát  trùng  với Povidine Iod 10%  (Betadine)  trong 10 phút,  sau đó rửa lại 2 lần bằng dung dịch PBS. Sau đó  dùng kéo lớn tách đôi răng để thu nhận mô tủy.  Nuôi cấy sơ cấp mô tủy răng  Mô  tủy  được  nuôi  sơ  cấp  theo  phương  pháp nuôi cấy mảnh mô của Trần Lê Bảo Hà  và cs. (2011).  Mẫu  tủy  răng  được  cắt  thành  nhiều mảnh  nhỏ. Sau đó, đặt phần mô  tủy  răng vào đĩa 35  mm và ép vào bề mặt  đĩa bằng  lamelle. Thêm  môi trường DMEM/F12 có bổ sung penicillin và  streptomycin vào đĩa nuôi. Môi trường trong đĩa  nuôi cấy được thay sau mỗi 2 ngày và ủ ở điều  kiện 37°C, 5% CO2.  Nuôi cấy thứ cấp  Khi tế bào đã phủ đầy bề mặt đĩa nuôi, tiến  hành cấy chuyền thứ cấp.  Rửa sạch đĩa nuôi bằng PBS, tiếp đến, dùng  trypsin/EDTA 0,25% để tách tế bào khỏi bề mặt  đĩa. Khi tế bào đã bong ra hoàn toàn, thêm môi  trường  DMEM/F12  vào  dung  dịch  rồi  huyền  phù.  Sau  đó,  cho  toàn bộ dung dịch  thu  được  vào  bình  nuôi  cấy.  Quá  trình  ủ  và  thay môi  trường được thực hiện tương tự như trong nuôi  cấy sơ cấp.  Khi  tế bào phát  triển phủ  đầy bề mặt  chai  nuôi, tiếp tục cấy chuyền để tạo các dòng tế bào  thứ cấp tiếp theo.  Nhận diện marker TBG  tủy  răng người bằng  phương pháp flow‐cytometry  Các  tế  bào  ở  lần  cấy  chuyền  thứ  4  được  nhuộm với 10μl kháng thể có các marker CD34,  CD73,  CD90,  CD13,  CD14  và  HLA‐DR.  Tiến  hành đánh giá marker bằng máy FACS Calibur  sử dụng phần mềm Cell Quest Pro.  KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN  Dung dịch chuyên chở sử dụng  Nước muối sinh lý là một dung dịch đẳng  trương với tế bào và mô cơ thể người, tạo môi  trường  thuận  lợi  cho  sự  trao  đổi  ion  và  lưu  thông  dịch  nội  –  ngoại  bào.  Vì  tính  thông  dụng, không mắc  tiền, khả năng duy  trì  tình  trạng  ổn  định  của  tế  bào  của dung dịch phù  hợp với yêu cầu đề  tài hướng đến nên chúng  tôi  chọn  nước  muối  sinh  lý  là  thành  phần  chính của dung dịch chuyên chở.  Gentamycin  là  kháng  sinh  nhóm  Aminoglycosides, có  tác dụng kiềm khuẩn phổ  rộng. Để phát huy tối đa sự tiện lợi và đơn giản  khi  pha  chế  dung  dịch,  chúng  tôi  sử  dụng  gentamycin  dạng  dung  dịch  (gentamycin  solfato,  80mg/2ml). Nồng  độ  gentamycin  được  khuyến cáo sử dụng trong nuôi cấy tế bào động  vật có vú là 50 μg/ml, nồng độ gây độc tế bào là  3000 μg/ml. Trong nghiên cứu trước đây, tác giả  Zhang  W  và  cs.  (2006)  sử  dụng  kháng  sinh  gentamycin  với  nồng  độ  500  μg/ml.  Vì  vậy,  chúng  tôi  sử dụng  gentamycin  ở  nồng  độ  480  μg/ml (tương ứng pha 3 chai gentamycin trong  500ml dung dịch nước muối sinh lý).  Kết  quả  thu  nhận  và  khử  nhiễm mô  tủy  răng người  Bảng 1: Kết quả xử lý mẫu ở các nhóm  Thời gian bảo quản Số mẫu Số mẫu nhiễm % số mẫu nhiễm 6 giờ 14 0 0% 9 giờ 16 0 0% 12 giờ 13 1 7,7% Chung 43 1 2,3% Không có mẫu mô tủy bị nhiễm khuẩn sau  khi  được  bảo  quản  trong  dung  dịch  chuyên  chở  6  giờ  và  9  giờ.  Đối  với nhóm  răng  được  bảo quản trong 12 giờ, có một mẫu mô  tủy bị  nhiễm  (tỉ  lệ 7,7%), ghi nhận ở ngày  thứ 3 sau  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014  Nghiên cứu Y học Răng Hàm Mặt  285 khi nuôi  cấy. Mẫu  bị nhiễm  khuẩn  được  thu  ngày 11/03/2013, răng khôn hàm dưới bên trái,  bệnh nhân 24 tuổi, giới tính nữ. Xét chung tất  cả các răng được thu thập trong nghiên cứu, tỉ  lệ  mẫu  bị  nhiễm  khuẩn  là  2,3%  (n=43).  Vì  không ghi nhận  được  đặc  điểm bất  thường  ở  mẫu nhiễm và sự khác biệt tỉ  lệ mẫu nhiễm ở  ba nhóm không có ý nghĩa thống kê nên chúng  tôi nghĩ nguyên nhân là do thao tác của người  thực hiện hoặc dụng cụ  làm việc đã bị nhiễm  khuẩn.  Theo Perry PC và cs. (2008) khi dùng PBS để  bảo quản răng, trong 40 răng bảo quản, có 7 mẫu  bị nhiễm sau 5 ngày nuôi cấy, chiếm tỉ lệ 17,5%.  Tuy  tác  giả  có  đề  cập  răng  việc  sử  dụng môi  trường HTS, PBS và MesenCult có thể bảo quản  răng đến 120 giờ ở 4°C sau khi nhổ nhưng  tác  giả không đề cập đến tỉ lệ răng bị nhiễm là bao  nhiêu. Vậy, môi trường chuyên chở do chúng tôi  đề nghị có hiệu quả trong việc bảo quản mô tủy  răng không bị nhiễm khuẩn.  Kết quả nuôi cấy tế bào tủy răng  Bảng 2: Kết quả nuôi cấy mảnh mô ở các nhóm  Thời gian bảo quản Số mẫu Số mẫu có tế bào bám dính % số mẫu có tế bào bám dính p* 6 giờ 14 13 92,9% 0,0279 giờ 16 12 75,0% 12 giờ 13 7 53,8% Chung 43 32 74,4% Theo Bảng 2, tỉ lệ mẫu nuôi cấy thành công  giảm dần qua 3 nhóm  thời gian. Sự giảm  tỉ  lệ  mẫu  nuôi  cấy  thành  công  phù  hợp  vì  môi  trường chuyên chở đề nghị không có chất dinh  dưỡng nên sức sống của  tế bào  sẽ giảm  đi khi  thời gian kéo dài.  Theo Perry BS và  cs.  (2008),  số  lượng TBG  tủy răng nuôi cấy được sau 14 ngày giảm có ý  nghĩa thống kê qua thời gian bảo quản (0 giờ, 24  giờ, 48 giờ và 72 giờ). Tuy nhiên, theo tác giả sự  giảm sút này không có ý nghĩa nhiều vì qua thời  gian nuôi cấy,  lượng TBG  tủy  răng sẽ  tăng  lên  nhanh  chóng.  Đồng  thời,  khi  tác  giả  nuôi  cấy  mẫu ngay sau khi nhổ răng (dùng PBS làm dung  dịch chuyên chở), chỉ có 31/40 (77,5%) mẫu có tế  bào bám dính sau 14 ngày nuôi cấy. Tuy nhiên,  có  khác  biệt  là  tác  giả  sử  dụng  phương  pháp  nuôi cấy tế bào đơn.  Bảng 3: Kết quả nuôi cấy mảnh mô ở nhóm bảo quản  6, 9, 12 giờ theo vị trí răng  Thời gian bảo quản Hàm trên Hàm dưới Có tế bào Không có tế bào Có tế bào Không có tế bào 6 giờ 5 (100%) 0 (0%) 8 (88,9%) 1 (11,1%) 9 giờ 4 (66,7%) 2 (33,3%) 8 (80,0%) 2 (20,0%) 12 giờ 3 (60,0%) 2 (40,0%) 4 (50,0%) 4 (50,0%) Chung 12 (75,0%) 4 (25,0%) 20 (74,1%) 7 (25,9%) Theo vị  trí  răng,  tỉ  lệ mẫu  răng  cho  tế bào  bám  dính  ở  2  nhóm  hàm  trên  và  hàm  dưới  tương  đương  nhau  (75,0%  và  74,1%). Kết  quả  này phù hợp vì các răng khôn hàm trên và hàm  dưới có mầm răng hình thành và khoáng hóa ở  thời điểm gần như cùng lúc với nhau và đều là  răng kế  tiếp. Mặc dù  các  răng khôn hàm dưới  chịu nhiều sang chấn hơn trong khi nhổ, nhưng  rõ  ràng  tiềm năng  cho TBG  tủy  răng khi nuôi  cấy của răng khôn hàm dưới và răng khôn hàm  trên  là như nhau. Như vậy, khi  tiểu phẫu nhổ  răng  khôn,  nếu  không  cắt  răng  sẽ  không  ảnh  hưởng xấu đến sức sống của các tế bào trong tủy  răng.  Từ  quá  trình  quan  sát  các mẫu  nuôi  cấy,  chúng tôi nhận thấy xuất hiện tế bào bám dính  trên đĩa nuôi sau 3 – 15 ngày nuôi cấy tùy theo  mẫu. Sau khi nuôi sơ cấp 15 – 20 ngày có hiện  tượng các tế bào hợp dòng và sau 4 – 5 tuần nuôi  sơ cấp thì các tế bào bám đầy đĩa và có thể cho  cấy chuyền để nuôi thứ cấp.  Theo Huang và cs. (2006), Trần Lê Bảo Hà  và cs. (2011), Hilkens P, Gervois P và cs. (2013)  nuôi  cấy mảnh mô  cho  ra  các  tế bào  có hình  dạng  giống  nguyên  bào  sợi,  nhưng  có  kích  thước  khác  nhau  và  hình dạng  ít  có  sai  biệt.  Đồng thời, tác giả cũng ghi nhận sau 2 – 3 tuần  thì  tế bào mới bám đầy đĩa nuôi và cho phép  cấy chuyền để nuôi cấy sơ cấp. So với Huang  Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Chuyên Đề Mắt – Tai Mũi Họng – Răng Hàm Mặt 286 và cs. (2006), tế bào của chúng tôi có hình dạng  tương  tự;  tuy  nhiên,  thời  gian  cần  để  cấy  chuyền  chậm  hơn.  Tuy  nhiên,  trong  cả  3  nghiên cứu trên, tác giả không bảo quản răng  qua các khoảng thời gian như nghiên cứu của  chúng tôi. Hơn nữa, dung dịch chuyên chở sử  dụng  trong  nghiên  cứu  này  không  có  chất  dinh dưỡng  để nuôi  tế bào nên  lượng  tế bào  còn sống trong tủy răng bị giảm đi. Tuy nhiên,  vì  nghiên  cứu  của  chúng  tôi  hướng  đến  việc  bảo quản TBG tủy răng nên không việc kéo dài  thời  gian  nuôi  cấy  không  có  ảnh  hưởng  đến  kết quả.  Nhận  diện  marker  TBG  tủy  răng  người  bằng phương pháp flow cytometry  Flow cytometry là một kỹ thuật có độ nhạy  cao dùng để xác định các marker bề mặt của tế  bào. Kỹ thuật này sử dụng phương pháp nhuộm  huỳnh quang gồm một kháng thể kháng marker  bề mặt có gắn màu huỳnh quang. Sau đó, các tế  bào  sẽ  được  di  chuyển  theo  dòng  chất  lỏng  xuyên  qua một  chùm  tia  sáng.  Khi  tế  bào  có  nhuộm huỳnh quang bị va đập bởi ánh sáng tập  trung  thì  chúng  phát  ra  những  tín  hiệu  khác  nhau. Tín hiệu này  được  cảm nhận  bằng máy  dò,  chuyển  đến  máy  tính  xử  lí  và  cung  cấp  thông tin.  Năm 2007, theo tiêu chuẩn của Tổ chức Liệu  Pháp Tế Bào Quốc Tế, TBG trung mô phải bám  dính được vào bề mặt nuôi cấy, biểu hiện dương  tính cao với các marker CD105, CD73, CD90 và  không  biểu  hiện  (dương  tính  thấp)  với  các  marker CD45, CD34, CD14 hoặc CD11b, CD79 a  hoặc CD19, HLA‐DR.  Bảng 3: Nhận diện marker TBG tủy răng người bằng phương pháp flow cytometry  Tên mẫu Các marker của TBG trung mô Các marker của TBG máu CD13 CD73 CD90 CD14 CD34 HLA-DR TR1 27-2 99,46% 99,91% 99,58% 10,58% 8,80% 7,91% TR3 01-3 99,56% 99,91% 99,68% 9,76% 7,92% 7,45% TR1 11-4 99,60% 99,85% 99,69% 9,71% 8,18% 7,67% Qua các thế hệ cấy chuyền, dòng tế bào thu  được  sẽ  thuần  chủng  hơn  nhờ  khả  năng  chọn  lọc. Theo kết quả chạy flow cytometry thế hệ P4  của ba mẫu, tất cả các marker đặc trưng cho TBG  trung mô đều biểu hiện từ 99,5% trở lên. Đối với  các marker đặc trưng cho các tế bào tạo máu, sự  biểu hiện khá thấp, dao động từ 7,5% đến 10,6%.  Đặc điểm của việc nuôi cấy mô là không có quá  trình chọn  lọc  tế bào ban  đầu nên vẫn  còn  lẫn  với các tế bào tạo máu khác. Tuy nhiên, nếu cấy  chuyền đến các thế hệ sau như P5, P6, dòng tế  bào  thuần hơn,  tỉ  lệ  tế bào dương  tính với  các  marker tế bào tạo máu sẽ giảm. Như vậy, quần  thể  tế bào P4  thu được có sự hiện diện của các  TBG tủy răng.  KẾT LUẬN  Nghiên  cứu  được  thực  hiện  trên  mẫu  nghiên  cứu  là  43  răng khôn vừa mới nhổ  tại  Khoa Răng Hàm Mặt. Các răng được bảo quản  bằng  dung  dịch  nước muối  sinh  lý  bổ  sung  gentamycin  theo  tỉ  lệ  3  ống  gentamycin  80mg/2ml và 500ml dung dịch nước muối sinh  lý. Từ các kết quả cho  thấy DDCC đề nghị có  khả năng bảo quản TBG tủy răng tương đương  với các dung dịch thường dùng trong 6 giờ. Ở  khoảng thời gian 9 giờ và 12 giờ thì khả năng  bảo quản thấp hơn. Như vậy, chúng tôi đã pha  chế  được DDCC  có hiệu quả bảo vệ  sự  sống  của  TBG  tủy  răng  bằng  với  các  dung  dịch  thường dùng trong 6 giờ ở điều kiện 4°C.  TÀI LIỆU THAM KHẢO  1. Gronthos  S, Mankani M,  Brahim  J,  Robey  PG,  and  Shi  S  (2000), “Postnatal human dental pulp  stem  cells  (DPSCs)  in  vitro and in vivo”, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 97, pp. 13625 –  13630.  2. Hoàng Tử Hùng, Huỳnh Kim Khang, Ngô Thị Quỳnh Lan,  Hoàng Đạo Bảo Trâm (2010), Mô phôi răng miệng, NXB Y học,  Hà Nội, tr. 111 – 168.   3. Huang GTJ, Sonoyama W, Chen  J, and Park SH  (2006), “In  vitro  characterization  of  human  dental  pulp  cells  various  isolation methods  and  culturing  environments”,  Cell Tissue  Res, 324, pp. 225 – 236.  4. Perry PC, Zhou D, Wu X, Yang FC, Byers MA, Chu TMG,  Hockema  JJ, Woods EJ  and Goebel WS  (2008),  “Collection,  Cryopreservation,  and  Characterization  of  Human  Dental  Pulp  – Derived Mesenchymal  Stem  Cells  for  Banking  and  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014  Nghiên cứu Y học Răng Hàm Mặt  287 Clinical Use”, Tissue Engineering, 14, pp. 149 – 156.  5. Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc  (2010), Công nghệ sinh học  trên người và động vật, NXB Giáo dục, TP. HCM, tr. 127 – 207.  6. Trần Lê Bảo Hà và cs.  (2011), “Nghiên cứu nuôi cấy  tế bào  gốc tủy răng và tạo khung nâng đỡ chứa tế bào gốc tủy răng  người”, Đề tài khoa học công nghệ, Trường ĐH Khoa Học Tự  Nhiên, ĐH Quốc Gia TP. HCM, tr. 12 – 29.  7. Zhang W, Walboomers F, Shi S, Fan M, and Jansen JA (2006),  “Multilineage Differentiation Potential of Stem Cells Derived  from  Human  Dental  Pulp  after  Cryopreservation”,  Tissue  Engineering, 12, pp. 2813 – 2823.  Ngày nhận bài báo: 21/11/2013  Ngày phản biện nhận xét bài báo: 11/12/2013  Ngày đăng báo: 05/01/2014 

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdf282_2117.pdf
Tài liệu liên quan