Đề tài Các phương pháp giải trình tự DNA (Sequencing)

CÁC PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ DNA ( SEQUENCING) I.Phương pháp hóa học( Maxam và Gilbert) : 1.Nguyên lý: Các đoạn DNA ( hoặc gene) có số lượng trình tự nucleotide giống nhau được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ P32 ở đầu 5’. Các đoạn DNA đã mang dấu phóng xạ được chia làm 4 nhóm. Mỗi nhóm được xử lý bằng các chất hóa học, hoặc hỗn hợp hóa học khác nhau nhằm bẻ gãy các đoạn DNA ở các vị trí khác nhau ở 1 hay 2 loại base N khác nhau. (Sau khi xử lý tạo thành các đoạn DNA bị cắt ngẫu nhiên có kích thước khác nhau. Bốn nhóm sau khi cắt được đem đi điện di trên gel polyacrylamide và thu được các băng DNA khác nhau theo thứ tự. Tùy theo đoạn nucleotide dài, ngắn khác nhau sẽ thu được trật tự băng khác nhau. Các đoạn nucleotide ngắn chạy nhanh nên ở xa điểm xuất phát. Các đoạn nucleotide dài chạy chậm nên ở gần điểm xuất phát. Nhờ phương pháp phóng xạ tự ghi, ta thu được các băng khác nhau trên bảng gel sau điện di. 2.Các bước giải trình tự theo phương pháp Maxam- Gilbert: Tách chiết DNA từ các mẫu nghiên cứu. Cắt DNA từ các mẫu và tạo các đoạn DNA giống nhau bằng kỹ thuật tạo dòng DNA (cloning). Gắn dồng vị phóng xạ P32 vào đầu 5’ của các đoạn DNA. Xử lý hóa chất thành 4 nhóm riêng biệt sao cho mỗi đoạn nucleotide chỉ bị hỏng ở một base N ( Mỗi nhóm chứa một số đoạn nucleotide có chiều dài khác nhau. Điện di sản phẩm của 4 nhóm trên gel polyacrylamide. Đoạn nucleotide ngắn sẽ chuyển động xa hơn, ngược lại đoạn nucleotide dài sẽ chuyển động chậm và ở gần điểm xuất phát. Chụp ảnh kết quả điện di bằng phương pháp phóng xạ tự ghi. So sánh kết quả thu được ở các mẫu khác nhau theo 4 nhóm.

  
Sơ đồ các bước giảI trình tự bằng phương pháp Maxam- Gilbert
Kết quả giải trình tự II.Phương pháp dideoxy: 1.Nguyên lý: Sử dụng enzyme DNA polymerase và các dideoxy. Dideoxy là các nucleotide mất cả 2 nhóm OH ở vị trí cacbon số 2 và 3 trên phân tử đường pentose. DNA polymerase xúc tác cho việc kéo dài chuỗi polynucleotide khi gặp các dideoxynucleotide (ddNTP) thì dừng lại. Do vậy các đoạn polynucleotide sẽ có chiều dài khác nhau. Đầu 3’OH cần cho việc hình thành liên kết phosphodiester ở chuỗi polynucleotide đang hình thành với các nucleotide kế tiếp. Việc thiếu nhóm 3’OH ở dideoxynucleotide dẫn đến chuỗi polynucleotide dừng lại. Người ta chỉ bổ sung các ddNTP với nồng độ khoảng 1% so với các dNTP. Do vậy khả năng gắn kết liên kết với các dNTP nhiều hơn với ddNTP. Từ đó sẽ cho các đoạn polynucleotide dài ngắn khác nhau. Nếu chia làm 4 nhóm với việc bổ sung 1% các loại ddNTP (riêng biệt) khi chạy điện di sẽ được 4 bảng điện di khác nhau. Các băng DNA xác định được nhờ việc gắn đồng vị phóng xạ vào mồi hoặc vào các dideoxy. 2.Các bước tiến hành: Biến tính DNA, bổ sung mồi có đánh dấu phóng xạ P32 TaqDNApolymerase, bổ sung đủ các loại dNTP cho vào dung dịch đệm thích hợp để thực hiện phản ứng tổng hợp DNA, sau đó chia làm 4 lô (4 ống eppendorg). Bổ sung vào mỗi lô 1 loại ddNTP với tỷ lệ 1%. Với tỷ lệ này thỉnh thoảng mới có 1 ddNTP được gắn ngẫu nhiên.( Nếu không đánh dấu bằng P32 ở mồi thì có thể dánh dấu P32 ở ddNTP).
Kết quả điện di phản ứng dideoxy với ddCTP Điện di các nhóm phản ứng bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide ở điều kiện biến tính để được các băng của các đoạn oligonucleotide có kích thước khác nhau. Thu kết quả các băng bằng phương pháp phóng xạ tự ghi: Chụp ảnh và phân tích kết quả. Có thể tiến hành giải trình tự cả 2 mạch của DNA khuôn để tránh sai sót.
Kết quả điện di phản ứng dideoxy với ddNTP III.Giải trình tự DNA tự động: 1. Nguyên lý: Dựa theo nguyên lý của phương pháp dideoxy được cải tiến dựa vào các thiết bị tự động hóa nhanh và chính xác hơn. Sự tự động hóa đã cải tiến tốc độ giải trình tự của mẫu, đặc biệt có ý nghĩa cho việc giải trình tự các khuôn mẫu lớn. Người ta không đánh dấu bằng chất đồng vị phóng xạ mà đánh dấu bằng chất huỳnh quang. Mỗi loại dideoxynucleotide được đánh dấu bằng 1 chất huỳnh quang (fluouchrome) có màu khác nhau ( Các phân đoạn DNA được đánh dấu phân biệt bởi các màu khác nhau. Khi sử dụng 4 loại dideoxynucleotide (ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP) có 4 màu khác nhau thì có thể giải trình tự mẫu nghiên cứu trong 1 phản ứng (1 giếng điện di) thay vì 4 phản ứng ( trong 4 giếng riêng biệt ) như phương pháp dideoxy của Sanger. Phần mềm máy tính sẽ tự động giải trình tự dữ liệu từ gel điện di và cho hình ảnh kết quả giải trình tự DNA. Các bước tiến hành: (Thành phần gồm:     DNA mẫu chứa khoảng 1010 phân tử, hoặc 1010 đoạn DNA dài khoảng 103-104bp. Các deoxynucleotide (dNTP). 4 loại dideoxynucleotide (ddNTP) có gắn màu huỳnh quang khác nhau, mỗi loại gắn một màu riêng biệt. Các enzyme cần thiết. Dung dịch đệm. Mồi xuôi và mồi ngược đặc hiệu cho đoạn cần nhân bản. Thể tích chung cho mỗi phản ứng là 20microlit (Tiến hành chạy PCR theo 3 bước chính: - Biến tính DNA ở 96oC làm cho DNA kép thành mạch đơn. Gắn mồi ở 50oC. Kéo dài chuỗi polynucleotide ở 60oC.
(Thực hiện khoảng 25 chu kỳ. Giữ phản ứng PCR ở 45oC trong 10 phút hoặc để qua đêm.
Nhân dòng bằng PCR Sản phẩm PCR được loại bỏ chất thừa. Kết tủa DNA bằng ethanol/EDTA. Hòa tan kết tủa sạch (bằng 15microlit HiDiFormamide do các hãng sản xuất cung cấp). Sau khi hòa tan kết tủa thì tiến hành điện di trên gel polyacrylamide. Kết quả thu được nhờ máy đọc trình tự và được xử lý bằng các phần mềm chuyên dụng.
Một kết quả giảI trình tự DNA tự động IV Tài liệu tham khảo: TS.Trịnh Đình Đạt. Công nghệ sinh học tập IV. Nhà xuất bản giáo dục(Trang 55-60) www.nucleics.com www.biochem.arizona.edu www.modares.ar.ir