Đề tài Nghiên cứu phương pháp nhân giống in vitro và in vivo giống hoa Loa kốn màu mới nhập nội

Phần 1 Mở đầu 1.1. Đặt vấn đề: Sản xuất hoa đang là một ngành rất phát triển, đem lại nguồn thu nhập đáng kể cho nền kinh tế quốc dân của nhiều nước trên thế giới như: Hà Lan, New Zealand, Canada, Nhật bản, Trung quốc... ở nước ta, so với các sản phẩm nông nghiệp khác, hoa là mặt hàng mang lại nhiều lợi nhuận (ước tính gấp 6 lần so với trồng lúa). Chính vì vậy, đây là một lĩnh vực đầy hứa hẹn đối với các nhà đầu tư. Trên thị trường hoa hiện nay, hoa lily hay còn gọi là Loa kèn màu là một trong những loại hoa được ưa thích nhất và chiếm thị phần xuất khẩu lớn trong ngành sản xuất hoa trên thế giới. Với kích thước lớn, màu sắc phong phú, mọc thành chùm lớn trông như những chiếc kèn Trumpet và đặc biệt là có mùi hương ngào ngạt, độ bền hoa cắt cao, chính vì vậy loại hoa này ngày càng được mọi người, mọi lứa tuổi đều ưa chuộng. Loa kèn cũng thích hợp ở nhiều nơi như: Trang trí trong nhà, lễ hội, mừng thọ, mừng sinh nhật... Với những người chơi hoa Việt Nam, từ trước chỉ biết đến loại hoa Loa kèn trắng, ít thơm nên đã bị thu hút ngay bởi màu sắc và nhất là hương thơm đặc biệt khó quên của các loại hoa Loa kèn màu, vì vậy nhu cầu tiêu thụ loại hoa này ngày càng tăng trên thị trường Việt Nam. Ngoài tiêu dùng trong nước, Loa kèn màu còn là một mặt hàng xuất khẩu quan trọng, có giá trị kinh tế cao. Tuy nhiên, hiện nay Loa kèn màu mới chỉ được trồng chủ yếu ở Đà Lạt với số lượng còn hạn chế, giá thành mỗi cành hoa lại cao (15.000 á 30.000 đ/ cành) nên chưa đáp ứng được nhu cầu đông đảo của người tiêu thụ. Ngoài ra do chưa đủ lượng giống cần thiết nên chúng ta vẫn phải nhập nội củ giống từ nước ngoài với giá thành cao. Một vấn đề nữa là Loa kèn màu ở nước ta đến nay mỗi năm chỉ trồng được một vụ (Từ tháng 4 á tháng 7). Trong khi đó, thị trường hoa nội địa, những ngày thường, có khi cung lớn hơn cầu nhưng trong các ngày lễ (Tết nguyên đán, 8/ 3...) thì giá thành lại tăng vọt, thiếu các giống hoa đẹp. Chính vì vậy sản xuất được giống hoa Loa kèn màu chất lượng cao, giá thành rẻ và đặc biệt là điều khiển ra hoa trái vụ là mong ước của cả nhà sản xuất lẫn tiêu thụ. Để giải quyết khâu giống, chúng ta đã có những nghiên cứu về nhân giống Loa kèn màu bằng phương pháp nuôi cấy in vitro, phương pháp này có ưu điểm là có hệ số nhân giống cao. Tuy nhiên quy trình nhân nhanh Loa kèn trong in vitro đến nay vẫn chưa được nghiên cứu hoàn thiện và chưa tạo được củ giống thương mại. Chính vì vậy, nhằm hoàn thiện quy trình nhân nhanh in vitro đồng thời khắc phục những yếu tố hạn chế trong nhân giống góp phần chủ động củ giống Loa kèn màu trong nước, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiờn cứu phương phỏp nhõn giống in vitro và in vivo giống hoa Loa kốn màu mới nhập nội” 1.2. Mục đích và yêu cầu của đề tài: 1.2.1. Mục đích của đề tài: Nghiên cứu phương pháp nhân giống hoa Loa kèn màu mới nhập nội trên cơ sở đó tiến tới hình thành quy trình nhân giống phục vụ sản xuất. 1.2.2. Yêu cầu của đề tài: * Phần 1: Nghiên cứu các khâu chính trong kĩ thuật nhân giống in vitro hoa Loa kèn màu. + Xác định hiệu quả của các ngưỡng thời gian khử trùng mẫu nuôi cấy. + Xác định môi trường nuôi cấy thích hợp, cho tỷ lệ tái sinh cao. + Xác định môi trường có hiệu quả cao cho quá trình nhân nhanh chồi Loa kèn màu (ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng riêng rẽ và tổ hợp). * Phần 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ thấp đến quá trình sinh trưởng và tạo củ của các củ Loa kèn màu vừa cho thu hoạch. + Xác định thời gian xử lý lạnh thích hợp cho quá trình phá ngủ củ Loa kèn màu. + Nghiên cứu hiệu quả của việc nhân giống bằng củ con. + Xác định tỷ lệ củ con thu được từ củ mẹ. Phần 2 tổng quan tài liệu 2.1. Tình hình sản xuất hoa Loa kèn màu trên thế giới và Việt Nam: 2.1.1. Tình hình sản xuất hoa Loa kèn màu trên thế giới: Trên thế giới, đặc biệt là các nước châu Âu, hoa Loa kèn màu đã gắn liền với cuộc sống của họ từ rất lâu đời. Là loại hoa không thể thiếu trong bất cứ lễ hội lớn nhỏ nào, vì vậy nhu cầu sản xuất và tiêu thụ Loa kèn màu ngày càng tăng qua các năm, điển hình ở một số nước như: Hà Lan, Đức, Bỉ, Italia... Hà lan được coi là xứ sở của nghề trồng hoa, năm 1995, giá trị nhập khẩu của thế giới là 6,8 tỷ USD, trong đó thị trường Hà Lan chiếm gần 50%. ở đây, cây Loa kèn được phát triển mạnh chỉ riêng nguồn cung cấp từ cây nuôi cấy mô tế bào đạt 8.020 triệu cây (Năm 1982 so với năm 1980 chỉ là 802 triệu cây, tăng gấp 10 lần) [5]. Còn diện tích trồng Loa kèn lấy củ tăng từ 100 ha năm 1966 đến khoảng 5.000 ha năm 2001 và thu được khoảng 1.000 triệu củ. Từ số lượng giống nói trên, hàng năm, nước này sản xuất hàng trăm triệu bông và củ giống phục vụ cho thị trường rộng lớn gần 80 nước trên thế giới [13]. ở Italia, trong 8.000 ha diện tích đất trồng trọt sinh lời 1,1 tỷ USD thì hoa Loa kèn là một trong những loài hoa kinh tế quan trọng bậc nhất chiếm 280 á 300 ha với tổng giá trị thu nhập 71 triệu USD/ năm. Nước này mỗi năm chi khoảng 152 triệu USD cho việc nhập củ hoa Loa kèn thô từ Phần Lan. Gần đây để giảm chi phí sản xuất giống, viện nghiên cứu ở Pesia đã tiến hành nghiên cứu và sản xuất củ Loa kèn với qui mô lớn [11]. ở châu Mỹ, bắc Mỹ cũng là một địa chỉ chuyên nghiên cứu về giống và sản xuất hoa Loa kèn với kĩ thuật cao như: Tạo giống ra hoa sớm, tạo cây có sức chống chịu, lai giữa các loài...[20]. ở Canada sản lượng Loa kèn tăng đều qua từng năm, thể hiện qua bảng sau: Năm Loại hoa 1998 1999 2000 Hoa cắt (triệu cành) 11.284 14.628 17.132 Hoa chậu (triệu chậu) 4.206 3.857 4.390 Châu á, với điều kiện khí hậu đa dạng, chi phí lao động thấp và nguồn đất đai dồi dào đã trở thành nơi quan trọng cho việc sản xuất hoa. ở Nhật, có 1.558 ha trồng các loại hoa có củ cho sản lượng hàng năm là 33,047 triệu Yên Nhật trong đó diện tích trồng Loa kèn chiếm 508 ha cho sản lượng hàng năm khoảng 15,068 triệu Yên Nhật [5]. Trung Quốc, là trung tâm lớn của sự phân bố hoa Loa kèn, với xấp xỉ 46 loài, chiếm gần 50% tổng số loài của thế giới. Loa kèn có mặt ở khắp đất nước, đặc biệt là Vân Nam, Tây Tạng. Tứ Xuyên [17]. 2.1.2. Tình hình sản xuất hoa Loa kèn màu ở Việt Nam: ở nước ta, hoa Loa kèn màu đang được xem là một trong bốn loại hoa quan trọng đang được nghiên cứu nhằm đưa loại hoa này thành mặt hàng xuất khẩu mũi nhọn của ngành trồng hoa Việt Nam trong tương lai. Hiện nay loại hoa này mới chỉ được trồng tập trung chủ yếu ở Đà Lạt, Sapa và một số vùng hoa ven Hà Nội với diện tích trồng nhỏ (Khoảng 80 ha). Như vậy với diện tích trồng còn nhỏ, hẹp, lượng hoa Loa kèn màu sản xuất ra trong một năm (Vài triệu cành hoa cắt) sẽ không đáp ứng được nhu cầu tiêu thụ ngày càng tăng của thị trường. Do đó, chúng ta phải đầu tư mở rộng quy mô sản xuất là biện pháp cần thiết phải giải quyết trước mắt, đồng thời về lâu dài, phải tập trung nghiên cứu nhân giống trong nước để giảm chi phí nhập nội củ giống từ nước ngoài. Nếu làm được như vậy, hoa Loa kèn màu sẽ đem lại một nguồn thu đáng kể cho ngành trồng hoa Việt Nam. 2.2. Giới thiệu chung về cây Loa kèn màu: Cây Loa kèn tên khoa học là Lilium longiflorum hybrids, thuộc nhóm một lá mầm (Monocotyendones), phân lớp hành (Lilidae), bộ hành (Liliales), họ hành (Liliaceae), chi Lilium (Dương Đức Tiến, Võ Văn Chi, 1978) [1]. Hiện nay Loa kèn có khoảng hơn 100 loài khác nhau, ngoài ra còn chưa kể đến những giống lai rất đa dạng và phong phú về màu sắc, chủng loại. Cây hoa Loa kèn là cây thân thảo, sống lâu năm nhờ rễ củ dạng hành mập, ngoài có lớp vẩy bao bọc. Thân tròn, cứng, mập, mọc thẳng đứng trên củ. Lá mọc dày đặc trên thân, tập trung nhiều ở gốc. Lá đơn, màu xanh bóng, hơi thẳng, thuôn và mềm. Hoa lưỡng tính, kích thước hoa lớn, mọc ở nách lá hoặc ở ngọn, có nhiều màu sắc khác nhau tuỳ từng giống: trắng, đỏ, vàng, tím-đỏ, trắng - đỏ, da cam, vàng có đốm đen... Các cánh hoa lớn giống nhau làm thành một ống dài, loe rộng ở đỉnh, thuỳ hoa lớn, uốn cong ra. Hoa có thể mọc riêng rẽ hoặc thành cụm. Bao hoa có sáu mảng dạng cánh, sáu nhị, bao phấn dài màu vàng, bầu hình trụ, đầu nhuỵ có ba thuỳ. Quả nang có nhiều hạt. Hiện nay có các loài Loa kèn màu trồng phổ biến như: + Lilium longiflorum (easter Lily): Là loài rất phổ biến, chủ yếu được trồng nhiều để sản xuất hoa cắt; Loài này có nguồn gốc từ Nhật Bản, hoa to, dạng phễu, có màu trắng tinh khiết, mùi hương dịu mát, cao khoảng 50 á 90cm, ra hoa sớm. + L.pardalinum: Có nguồn gốc từ Califocrnia (Mỹ), thường được gọi là hoa Lily đốm do hoa có màu cam và những đốm nâu sẫm, hoa khi nở rủ xuống và đung đưa trước gió trông giống như những chiếc đèn lồng đẹp một cách kỳ lạ; Thân cao khoảng 150 á 200 cm, thường được dùng để lai tạo các giống Lily mới. + L.regale: Nguồn gốc từ Trung Quốc, hoa màu trắng, nở vào khoảng giữa mùa hè, có hương thơm ngọt ngào. + L.Tigrinum (Tiger Lily): Đến từ Trung Quốc, hoa dạng phễu, cánh uốn cong, màu vàng nhạt, có sọc tía (Đen), nhị nhỏ, thân củ màu đen. Ngoài ra hoa còn có các màu như đỏ sẫm, hồng - da cam, đỏ nhạt. + L.Hansonii (Yellow Martagon Lily hay Japanese Turk’s - cap): Có nguồn gốc từ Hàn Quốc và Siberia; Có từ 6 đến 10 hoa, màu vàng với những chấm màu tối, hoa xuất hiện vào tháng 6, thân cây cao khoảng 100 á 125 cm; Là loài được dùng phổ biến trong công tác lai tạo giống (Hansonii hybrids và Backhouse hybrids). + L.Davidii: Từ Trung Quốc, hoa màu đỏ vàng, cánh hoa uốn cong. + L.Amabile: Hoa màu vàng da cam, với những đốm đen. ở Việt Nam, ngoài giống hoa Loa kèn trắng được trồng phổ biến nhất, thì mới chỉ tìm ra 2 loài khác là cây hoa bách hợp (L.Brownii F.E Brown waroldiesterri wils) mọc hoang dại trên núi đá ở Lạng Sơn, Cao Bằng và loài L.Poilanei Gagnep có ở đồi cỏ Sapa - Hoàng Liên Sơn. 2.3. Các phương pháp nhân giống Loa kèn màu: 2.3.1. Kỹ thuật nhân giống ngoài đồng ruộng (in vivo): 2.3.1.1. Nhân giống bằng củ: Đây là phương pháp nhân giống cổ truyền của bà con nông dân vẫn được áp dụng từ trước đến nay. Củ sau khi thu hoạch (Cắt hoa) được đem vào bảo quản 4 á 5 tháng rồi đem trồng ở vụ sau (Từ tháng 10 á tháng 11). Ưu điểm chính của phương pháp này là đơn giản, dễ làm, nhưng lại có nhược điểm là hệ số nhân giống thấp, làm thoái hoá củ giống do sản xuất nhiều vụ và khó ngăn chặn được sự lây lan cả bệnh virus do sử dụng thế hệ củ qua nhiều năm. 2.3.1.2. Nhân giống bằng vẩy củ: Từ củ hoa Loa kèn dạng vảy hành, ta tách các vảy củ sau đó đem trồng để tạo củ giống. Sau khoảng 2 tháng trồng, trên các vảy củ sẽ xuất hiện các chồi và dạng củ nhỏ. Ta tiếp tục trồng nuôi các củ con này trong 2 á 3 vụ sẽ thu được củ Loa kèn trưởng thành có khả năng cho năng suất [19]. Đây là phương pháp nhân giống mới, tuy vẫn còn tồn tại hiện tượng lây lan bệnh nhưng hệ số nhân giống cao hơn. Phương pháp này được đánh giá là có triển vọng trong sản xuất, vì vậy, việc khắc phục sự lây lan bệnh và rút ngắn thời gian nuôi củ là rất cần thiết. 2.3.1.3. Nhân giống bằng củ con phát sinh trên thân cây mẹ: Trên thân cây hoa Loa kèn, sau khi đã thu hoạch một thời gian, ở vị trí gần gốc và đỉnh ngọn phát sinh ra những củ Loa kèn con. Có thể tách những củ con này đem trồng nuôi cho củ lớn nhằm tạo được củ trưởng thành có khả năng cho năng suất đồng thời làm tăng số lượng củ giống. Đây là phương pháp nhân giống Loa kèn mới, còn rất ít những nghiên cứu về biện pháp này. 2.3.1.4 Cơ sở sinh lý sự hình thành, sự ngủ nghỉ của củ và căn hành [9]: Củ và căn hành là những cơ quan chứa nhiều chất dự trữ gluxit và lipit ở phần thân phình ra dưới mặt đất (Củ khoai tây), hoặc rễ (Củ cải) hoặc phần gốc cuống lá (Củ hành, tỏi...). Củ sinh trưởng bằng sự phân chia và dãn của tế bào đồng thời có sự tích luỹ mạnh mẽ các hợp chất gluxit và tinh bột. Trong khi đó căn hành được tạo nên do kết quả của việc tập trung gluxit ở phần gốc cuống lá non, đồng thời sự phân chia của mô phân sinh ngọn ngừng và sự sinh trưởng của căn hành bằng sự dãn của tế bào ở gốc cuống lá. Sự hình thành củ và căn hành cũng là những quá trình có tính chất tương quan sinh trưởng. Hệ thống rễ phát triển có ảnh hưởng ức chế sự hình thành củ, trong khi đó các lá trưởng thành, nơi sản sinh nhiều tác nhân ức chế, lại kích thích sự hình thành củ. Vì vậy, củ và căn hành bắt đầu hình thành vào cuối giai đoạn sinh trưởng phát triển dinh dưỡng khi các cơ quan dinh dưỡng bắt đầu ngừng sinh trưởng. Sau đó sự phình to của củ và căn hành xảy ra vào giai đoạn sinh trưởng phát triển sinh sản, khi các cơ quan dinh dưỡng ngừng hẳn sinh trưởng, các cơ quan sinh sản và dự trữ hình thành mạnh mẽ. Sự hình thành củ và căn hành được điều chỉnh bằng sự cân bằng hormon trong cơ thể. Auxin kích thích sự hình thành rễ, ức chế sự hình thành củ và căn hành. Gibberellin kích thích sự sinh trưởng của tia củ nhưng ức chế sự hình thành củ và căn hành. Axit absxixic là chất ức chế sinh trưởng của chồi và rễ, được hình thành trong lá, ức chế sự sinh trưởng của tia củ và kích thích sự phình to của củ. Cytokinin là chất cảm ứng hình thành chồi, hình thành trong rễ và kích thích sự hình thành tia củ và sự phình to của củ. Sự hình thành củ và căn hành được điều chỉnh bằng sự cân bằng hormon trong cây. Sự cân bằng quan trọng nhất là sự cân bằng giữa Gibberillin (GA3) và Axit absxixic (ABA). Củ và căn hành sau khi thu hoạch bước và một thời kỳ ngủ nghỉ sinh lý. Trong thời gian ngủ nghỉ thì giảm sút một cách đáng kể cường độ trao đổi chất, hoạt động sinh lý, sinh hoá dẫn đến cây ngừng sinh trưởng. Sự ngủ nghỉ được xem là một đặc tính của loài. Nguyên nhân của sự ngủ nghỉ là do tích luỹ một lượng lớn các chất ức chế sinh trưởng như: Axit Absxixic, các hợp chất Phênol. Trong khi đó làm giảm hàm lượng các chất kích thích sinh trưởng như: Auxin, Gibberellin, Cytokinin, làm cho cân bằng hormon (Chủ yếu là ABA/ GA3 ) lệch về phía tích luỹ nhiều ABA. Người ta có thể phá ngủ củ và căn hành dựa trên nguyên tắc dùng các tác nhân lý, hoá như: Nhiệt độ thấp, thay đổi thời gian chiếu sáng, bổ sung chất kích thích sinh trưởng (GA3) để cân bằng dịch chuyển về phía tích luỹ nhiều GA3. Năm 1994, bộ môn sinh lý thực vật, Đại học Nông nghiệp I - Hà Nội đã thành công với nghiên cứu phá ngủ củ Loa kèn trắng bằng xử lý lạnh kết hợp với phun GA3 đã điều khiển được cây Loa kèn ra hoa trái vụ [5]. 2.3.2. Kỹ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào (in virto) [10]: 2.3.2.1. Các giai đoạn chính trong quá trình nhân giống in vitro: Nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào là một phương pháp mới, hiện đại và đã được áp dụng trên nhiều đối tượng khác nhau trong đó có cây hoa Loa kèn, quy trình nhân giống chung gồm các giai đoạn sau: + Giai đoạn chuẩn bị: Nhằm tạo ra cây giống tốt, bước đầu tiên rất quan trọng là phải chọn cây mẹ khoẻ, sạch bệnh, có đủ những đặc tính mà ta quan tâm. Trên cây mẹ, có thể sử dụng nhiều cơ quan, bộ phận khác nhau làm mô nuôi cấy như: Đỉnh chồi, mắt ngủ, mô lá non, vẩy củ, bao phấn… + Giai đoạn 2: Khử trùng mô nuôi cấy Do mô nuôi cấy đưa từ ngoài vào có chứa rất nhiều vi sinh vật. Vì vậy cần khử trùng mô nuôi cấy trước khi đưa vào môi trường dinh dưỡng nhân tạo nhằm tạo ra nguyên liệu thực vật vô trùng có tỷ lệ nhiễm vi sinh vật thấp, tỷ lệ mẫu sống sinh trưởng tốt và cao. Giai đoạn này phụ thuộc vào hai nhân tố là thời gian khử trùng và nồng độ chất khử trùng. Các hoá chất thường được sử dụng để khử trùng là HgCl2 0,1% từ 5 đến 10 phút, Ca(OCl)2 5 á 7% từ 15 đến 20 phút, NaClO 1% từ 15 á 20 phút. + Giai đoạn 3: Nuôi cấy khởi động ở giai đoạn này mô nuôi cấy sau khi được khử trùng được chuyển vào môi trường thích hợp về tỷ lệ và hàm lượng các chất điều tiết sinh trưởng để kích thích mẫu cấy hình thành chồi bất định, các phôi vô tính hay kích thích các chồi nách, mắt ngủ bật mầm. + Giai đoạn 4: Nhân nhanh Là giai đoạn quan trọng của quá trình nhân giống in vitro vì giai đoạn này xác định hệ số nhân của quá trình nhân giống in vitro. Môi trường nuôi cấy nhân tạo có các chất điều tiết sinh trưởng như: Auxin, Cytokinin, đồng thời phải chú ý đảm bảo những điều kiện ngoại cảnh như nhiệt độ, ánh sáng, quang chu kỳ... + Giai đoạn 5: Tạo cây hoàn chỉnh Là giai đoạn chuyển những chồi đã hình thành trong giai đoạn nhân nhanh sang môi trường tạo rễ để hình thành cây có đủ rễ, thân, lá, đủ tiêu chuẩn là cây giống. Môi trường tạo rễ thường bổ xung auxin để kích thích hình thành rễ. + Giai đoạn 6: Đưa cây in vitro ra đất Đây là bước quyết định để đánh giá thực tiễn của quy trình nhân giống in vitro. Nên các loại giá thể trồng cây in vitro phải đảm bảo độ sạch vi khuẩn, xốp và thoáng khí giúp cây con đạt tỷ lệ sống cao. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào có một số ưu điểm đó là có hệ số nhân giống rất cao, nhân nhanh được các giống cây sạch bệnh, đa dạng hoá nguồn gen, đáp ứng được nhu cầu thưởng thức của người tiêu dùng. 2.3.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nhân giống: * Môi trường nuôi cấy: Là yếu tố quyết định cho sự sinh trưởng, phát triển của mô trong nuôi cấy. Môi trường nuôi cấy bao gồm một số thành phần cơ bản sau: + Các nguyên tố đa lượng: Gồm N, P, K, S, Mg, Ca. Chúng có chức năng là nguyên liệu để xây dựng nên các thành phần cấu trúc của mô tế bào và mô thực vật. Hàm lượng của các nguyên tố đa lượng phải > 30 mg/ l mặc dù tỷ lệ giữa các nguyên tố này có thể biến đổi. + Các nguyên tố khoáng vi lượng: Bao gồm Fe, Bo, Mn, I, Mo, Cu, Zn. Chúng tham gia vào thành phần của các enzim xúc tác cho phản ứng hoá sinh diễn ra trong tế bào. Hàm lượng các yếu tố vi lượng thường < 30 mg/ l. + Nguồn cacbon hữu cơ: Trong nuôi cấy mô, cây sinh trưởng, phát triển được nhờ sự kết hợp cả 2 phương thức: Dị dưỡng và tự dưỡng. Chính vì vậy, bổ xung nguồn cacbon hữu cơ vào môi trường là cần thiết. Nguồn cacbon hữu cơ thường sử dụng là đường saccaroza 2 á 3%. + Các vitamin: Các mô tế bào khi nuôi cấy in vitro vẫn có khả năng tổng hợp vitamin nhưng lượng đó không đủ để cung cấp cho hoạt động sống của cây do đó phải bổ xung các vitamin vào môi trường nuôi cấy với hàm lượng thích hợp. Thường bổ xung các vitamin nhóm B như: B1, B2, B3, B5, B6. + Các chất điều tiết sinh trưởng thực vật: Là các chất đảm bảo cho việc điều khiển sự phân hoá và phản phân hoá trong nuôi cấy in vitro, thường sử dụng 2 nhóm Auxin và Cytokinin. + Các hợp chất tự nhiên như nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch nghiền của khoai tây, chuối được bổ xung vào môi trường nhằm làm tăng cường thêm các axit amin, vitamin cũng như nhiều yếu tố dinh dưỡng khác. + Agar: Là chất làm đông cứng môi trường tạo điều kiện cho mẫu cấy sinh trưởng, phát triển tốt. + PH môi trường: PH thích hợp cho phần lớn các mô nuôi cấy là 5,5 á 5,8. 2.3.2.3. Cơ sở sinh lý của các biện pháp nhân giống in vitro: Là tính toàn năng của tế bào thực vật thể hiện qua quá trình phân hoá và phản phân hoá tế bào. Mỗi tế bào của bất kì sinh vật nào cũng đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của sinh vật đó. Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh gọi là tính toàn năng của tế bào. Sự phân hoá tế bào là sự chuyển từ các tế bào phôi sinh thành các tế bào của mô chuyên hoá, đảm nhận các chức năng khác nhau. Tế bào phôi sinh Tế bào dãn Tế bào chuyên hoá Sự phản phân hoá tế bào là sự chuyển các tế bào chuyên hoá trở lại dạng tế bào phôi sinh. Phân hoá tế bào Tế bào phôi sinh Tế bào dãn Tế bào chuyên hoá Phản phân hoá tế bào Tính toàn năng của tế bào được thể hiện qua quá trình phân hoá và phản phân hoá tế bào trong những điều kiện nhất định. Trong môi trường nuôi cấy mô, sự phối hợp hàm lượng và tỷ lệ của các chất điều tiết sinh trưởng thuộc 2 nhóm Auxin và Cytokinin có tác dụng điều chỉnh quá trình phân hoá và phản phân hoá của mô nuôi cấy. 2.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước: 2.4.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước: Năm 1969, Gauthret nghiên cứu hàm lượng dinh dưỡng muối khoáng có vai trò trong sự sinh trưởng và phân chia tế bào khi nuôi cấy mô hoa Loa kèn. Năm 1980, Van Aartrifk và Blom, đã tìm ra môi trường thích hợp cho nuôi cấy Loa kèn là môi trường MS có hàm lượng muối khoáng giảm một nửa sẽ cho khả năng tái sinh chồi cao. Khi nghiên cứu nguồn vật liệu nuôi cấy ban đầu Robb (1957) và Allen (1974) đã chỉ ra bộ phận nuôi cấy thích hợp nhất với cây Loa kèn là vẩy củ. Khi nuôi cấy vẩy củ đã rút ngắn thời gian tái sinh chồi và tỷ lệ tái sinh chồi luôn cao hơn các bộ phận khác. Năm 1993, Stanilova. M và Zagorska (Bungari) cũng khẳng định vẩy củ là nguyên liệu tốt nhất cho việc tái sinh chồi từ mô nuôi cấy trên môi trường Skoog có bổ xung 0,5 mg aNAA/ l và 0,1 mg Kinetin/ l, tạo ra các cây giống đồng đều về chất lượng. Năm 1981, Van và Blom đã xác định được vai trò của aNAA trong sự tái sinh chồi. Ngoài ra còn có BA cũng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng phát triển của chồi. Năm 2000, J. Suh và J. Lee đã nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ và chất lượng ánh sáng đến sự hình thành củ Loa kèn con và cho thấy ở nhiệt độ 20 á 250C, số lượng, khối lượng và đường kính của củ con tăng hơn so với ở nhiệt độ 300C, số lượng củ con cũng cao hơn khi ở dưới ánh sáng đỏ [15]. Các nghiên cứu về sự xuân hoá củ bằng nhiệt độ thấp cũng được J. Lee, Young A.Kim tiến hành và xác định được thời gian xử lý lạnh từ 4 tuần trở lên ở 50C thì các củ nảy chồi và ra hoa sớm hơn, số lượng hoa cũng tăng lên [16]. 2.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước: ở nước ta hiện nay, những nghiên cứu về nhân giống hoa Loa kèn trắng trong nước hay một số giống Loa kèn màu mới nhập nội chỉ mới tập trung vào biện pháp nhân giống in vitro chứ chưa tập trung đến các biện pháp nhân giống in vivo, vì vậy có rất ít nghiên cứu về biện pháp này. Nhân giống ngoài đồng ruộng in vivo chỉ được nhắc đến như là biện pháp nhân giống cổ truyền trong một số tài liệu giới thiệu về kĩ thuật trồng và chăm sóc hoa - cây cảnh trong đó có cây hoa Loa kèn [5]. Năm 1993, Mai Xuân Lương và cộng sự đã thăm dò quy trình nhân giống cây hoa Loa kèn trên môi trường đa lượng với các mức dinh dưỡng khác nhau như MS, White, Knop cho thấy tốt nhất vẫn là môi trường MS và bổ sung các nguyên tố vi lượng (Theo Heller), vitamin (Theo Morel), 100mg inositol/ l, 20g đường saccaroza và 15g Agar/ l [4]. Năm 1994, Dương Tấn Nhựt đã công bố kết quả nghiên cứu giống hoa Loa kèn bằng phương pháp nuôi cấy vẩy củ. Vẩy củ được khử trùng bằng HgCl2 0,2% trong 5 phút, sau đó cấy lên môi trường MS có bổ sung các thành phần vitamin, chất hữu cơ và saccaroza. Sau khi tạo được cây con, có thể tiếp tục nhân bằng cách tách các vẩy củ đã được tạo thành đem cấy trên môi trường nhân [6]. Năm 1996, Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Nhẫn, Nguyễn Phương Thảo đã nghiên cứu sử dụng phương pháp nuôi cấy in vitro trên giống hoa Loa kèn tím mới nhập nội từ Pháp và đưa ra quy trình nhân giống kể từ khi đưa mẫu vào cho đến khi sản xuất ra củ giống [7]. Năm 2001, Dương Tấn Nhựt và cộng sự nghiên cứu nhân giống hoa Huệ tây sạch bệnh qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Đỉnh sinh trưởng được tách từ chồi đỉnh của củ Loa kèn, được khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong 7 phút sau đó cấy vào môi trường 1/2 MS. Sau khi tạo được cây hoàn chỉnh có thân chính phân đốt, tiến hành cắt thân chính thành nhiều đốt nhỏ để tiến hành nhân nhanh. Cũng trong năm 2001, Nguyễn Thị Nhẫn và Nguyễn Quang Thạch đã thành công trong nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật tạo củ in vitro trong công tác nhân giống cây hoa Loa kèn [8]. Phần 3 đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu 3.1. Đối tượng nghiên cứu: + Hai giống Loa kèn màu nhập nội từ Trung Quốc có màu tím - đỏ và màu vàng. + Nguyên liệu nuôi cấy ban đầu: Vẩy củ loa kèn màu. + Nguyên liệu cho thí nghiệm tạo củ: Cây con được tái sinh từ vật liệu nuôi cấy ban đầu. + Nguyên liệu cho thí nghiệm ngoài vườn: Các cây có đủ số lá và số rễ trung bình trên cây. + Nguyên liệu cho thí nghiệm phá ngủ: Các củ vừa cho thu hoạch hoa. + Nguyên liệu cho thí nghiệm nhân giống từ củ mẹ: Những cây đã cho hoa nhưng vẫn tiếp tục trồng để hình thành củ con. + Nguyên liệu cho thí nghiệm nhân giống bằng củ con: Những củ con được hình thành từ củ mẹ. Hình 1: Lilium longiflorum x Aziatsche Gr. “Centurion” Hình 2: Lilium Oriental “Sta Gazer” 3.2. Nội dung nghiên cứu: 3.2.1. Nhân giống in vitro: 3.2.1.1. Thí nghiệm khử trùng: Gồm 3 công thức về thời gian khử trùng. CT1: Khử trùng mẫu trong 5 phút bằng HgCl2 0,1%. CT2: Khử trùng mẫu trong 7 phút bằng HgCl2 0,1%. CT3: Khử trùng mẫu trong 10 phút bằng HgCl2 0,1%. 3.2.1.2. Thí nghiệm tái sinh mẫu: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng tái sinh chồi của vảy củ. + Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của aNAA đến khả năng tái sinh của mô nuôi cấy. CT1: MS (ĐC) CT2: MS + 0,1 ppm aNAA CT3: MS + 0,3ppm aNAA CT4: MS + 0,5ppm aNAA + Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng tái sinh của mô nuôi cấy. CT1: MS (ĐC) CT2: MS + 0,5 ppm BA CT3: MS + 1 ppm BA CT4: MS + 2 ppm BA CT5: MS + 3 ppm BA CT6: MS + 4 ppm BA + Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của sự tổ hợp BA và aNAA đến khả năng tái sinh của mô nuôi cấy. CT1: MS (ĐC) CT2: MS + 0,3ppm aNAA + 0,5 ppm BA CT3: MS + 0,3ppm aNAA + 1 ppm BA CT4: MS + 0,3ppm aNAA + 2 ppm BA CT5: MS + 0,3ppm aNAA + 3 ppm BA CT6: MS + 0,3ppm aNAA + 4 ppm BA 3.2.1.3. Thí nghiệm nhân nhanh: + Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA