Đề tài Sắc ký trao đổi ion hiệu năng cao

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC DÂN LẬP VĂN LANG KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC LỚP K13S2 GVHD: ThS. CAO NGỌC MINH TRANG Đặng Thị Bích Phương Phạm Huỳnh Mai Trần Thị Yến Vân Nguyễn Thị Thương Trần Lê Đình Đại Nguyên 1. Nguyễn Thanh Bá 2. Nguyễn Ngọc Khánh 3. Nguyễn Ngọc Minh Châu 4. Nguyễn Thị Kim Sa 5. Phạm Ngọc Đan Thanh 6. Võ Hưng Minh Thư SVTH: PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (High Performance Liquid Chromatography) Phương pháp chia tách : pha động là chất lỏng. pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng đã phủ lên một chất mang rắn hay là một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ. FG HPLC NP HPTLC KỸ THUẬT HPLC RP IE PC NP RP IE PC CLIP SƠ ĐỒ CẤU TẠO VÀ NGUYÊN LÝ HOẠT ĐỘNG CỦA HPLC QUÁ TRÌNH SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION TRONG HPLC Sắc kí trao đổi Ion (IC) là một quá trình cho phép phân tách các ion hay các phân tử phân cực dựa trên tính chất của chúng Pha động chỉ có thể là chất lỏng. Việc ứng dụng sắc ký trao đổi ion vào kỹ thuật HPLC đòi hỏi pha động phải đáp ứng được các yêu cầu sau : Phù hợp với detector sử dụng. Trơ đối với pha tĩnh Phải hoà tan được mẫu phân tích Phải bền vững theo thời gian Có độ tinh khiết cao Nhanh đạt đến cân bằng trong quá trình tách Các loại dung môi được sử dụng làm pha động trong HPLC : metanol, axetonitril, benzen, n-hexan, nước Pha tĩnh là chất rắn, là những hạt hình cầu rất nhỏ, có cấu tạo hoá học là polymer, nên được gọi là các hạt nhựa. Bề mặt của hạt mang các nhóm chức ở dạng ion. QUÁ TRÌNH SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION TRONG HPLC Có hai loại nhựa: Nhựa trao đổi anion mang nhóm chức có điện tích dương nên nhựa bắt giữ các ion âm của pha động. Nhựa trao đổi cation mang nhóm chức có điện tích âm nên nhựa bắt giữ các ion dương của pha động. A Cation exchange resin with bound positive counterions B Anion exchange resin with bound negative counterions Các yêu cầu đối với pha tĩnh sử dụng trong HPLC : QUÁ TRÌNH SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION TRONG HPLC Cỡ hạt phải tương đối đồng nhất Trơ và bền vững với các điều kiện trong môi trường sắc ký Có khả năng tách chọn lọc một hỗn hợp chất tan trong điều kiện sắc ký nhất định Tính chất bề mặt phải ổn định Có độ tinh khiết cao Nhanh đạt các cân bằng động học Các nguyên liệu sử dụng làm pha tĩnh Pha tĩnh trên nền silica gel Pha tĩnh trên nền nhôm oxit Pha tĩnh trên nền hợp chất cao phân tử Pha tĩnh trên nền mạch Cacbon QUÁ TRÌNH SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION TRONG HPLC R : pha tĩnh còn được gọi là nhựa (resin). G : nhóm chức mang điện tích được cố định trên pha tĩnh. Còn được gọi là nhóm chức hoạt động của nhựa. C : đối –ion của G. S : chất hữu cơ có mang điện tích trái dấu với G. QUÁ TRÌNH SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION TRONG HPLC QUÁ TRÌNH SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION TRONG HPLC XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CACBONHYDRAT TỰ DO VÀ TỔNG SỐ TRONG CÀ PHÊ HOÀ TAN Hàm lượng Cacbonhydrat tự do : là hàm lượng của mỗi monosaccarit riêng lẻ (arabizona, fructoza, galactoza, glucoza, manoza) và hàm lượng sucroza, manitol. Hàm lượng được biểu thị bằng phần trăm khối lượng chất khô. Phương pháp A : 1. Hoà tan phần mẫu thử vào nước. 4. Định lượng mẫu bằng việc so sánh với diện tích pic của dung dịch tiêu chuẩn 3. Phát hiện mẫu dựa trên tính chất điện hoá của hợp chất rửa giải bằng detector xung ampe (PDA) 2. Tách bằng sắc ký các cacbonhydrat có trong dịch chiết Hàm lượng Cacbonhydrat tổng số : là hàm lượng của mỗi monosaccarit riêng lẻ (arabizona, fructoza, galactoza, glucoza, manoza, xyloza) và hàm lượng manitol. Hàm lượng được biểu thị bằng phần trăm khối lượng chất khô. Phương pháp B : 1. Thuỷ phân phần mẫu thử bằng axit clohydric 2. Phân tích cacbonhydrat có trong dung dịch thuỷ phân đã được lọc như phương pháp A XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CACBONHYDRAT TỰ DO VÀ TỔNG SỐ TRONG CÀ PHÊ HOÀ TAN XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CACBONHYDRAT TỰ DO VÀ TỔNG SỐ TRONG CÀ PHÊ HOÀ TAN Chất rửa giải 2 : dung dịch natri hydroxit Natri hydroxit 50% (m/m) dung dịch nước Thuốc thử : Chất rửa giải 1 : nước đã khử khoáng Axit clohydric Chú ý : loại bỏ dioxit cacbon hoà tan từ các chất rửa giải ra trước khi sử dụng Dung dịch tiêu chuẩn cacbonhydrat Thiết bị dụng cụ : Máy sắc ký lỏng không chứa kim loại, có cột trao đổi anion hiệu năng cao, được nạp đầy hạt nhựa polystyren – divinylbenzen, có cột chắn và hệ thống bơm cột hậu. Detector xung Ampe (PDA), có điện cực bằng vàng Lấy mẫu : Tuân theo tiêu chuẩn TCVN 6605 : 2000 XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CACBONHYDRAT TỰ DO VÀ TỔNG SỐ TRONG CÀ PHÊ HOÀ TAN Cách tiến hành : Xác định chất khô : Tính lượng chất khô xác định được trong mẫu thử của phòng thí nghiệm theo TCVN 5567 : 2001 Cân 300g mẩu thí nghiệm Bình định mức V = 100ml Pha loãng Lọc 5 – 10ml 70ml nước và lắc Chuẩn bị mẫu phân tích – Phương pháp A Cân 300g mẩu thí nghiệm Bình định mức V = 100ml 50ml HCl và khuấy Đun sôi Làm nguội Pha loãng và lọc Chuẩn bị mẫu phân tích – Phương pháp B XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CACBONHYDRAT TỰ DO VÀ TỔNG SỐ TRONG CÀ PHÊ HOÀ TAN Cách tiến hành : XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CACBONHYDRAT TỰ DO VÀ TỔNG SỐ TRONG CÀ PHÊ HOÀ TAN Cách tiến hành : Phân tích sắc ký Lắp đặt thiết bị Điều chỉnh thiết bị Lọc các dung dịch Nhận biết và định lượng cacbonhydrat Bơm XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CACBONHYDRAT TỰ DO VÀ TỔNG SỐ TRONG CÀ PHÊ HOÀ TAN Cách tiến hành : Bảng 1 : Chuẩn bị cột XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CACBONHYDRAT TỰ DO VÀ TỔNG SỐ TRONG CÀ PHÊ HOÀ TAN Cách tiến hành : Bảng 2 : Các điều kiện để phân tích XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CACBONHYDRAT TỰ DO VÀ TỔNG SỐ TRONG CÀ PHÊ HOÀ TAN Cách tiến hành : Tính toán : Hàm lượng cacbonhydrat (ω) biểu thị bằng phần trăm khối lượng A : diện tích pic của cacbonhydrat riêng lẻ trong dung dịch thử A0 : diện tích pic của cacbonhydrat riêng lẻ trong dung dịch tiêu chuẩn m : khối lượng của phần mẫu thử trong dung dịch thử, tính bằng gam khối lượng chất khô m0 : khối lượng của cacbonhydrat trong dung dịch tiêu chuẩn, tính bằng gam V : thể tích dung dịch thử, tính bằng mililit V0 : thể tích dung dịch tiêu chuẩn, tính bằng mililit XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CACBONHYDRAT TỰ DO VÀ TỔNG SỐ TRONG CÀ PHÊ HOÀ TAN Bảng 3 : Kết quả phân tích Th.S CAO NGỌC MINH TRANG – Giáo trình Phương pháp Hoá Sinh hiện đại TÀI LIỆU THAM KHẢO THANKS FOR YOUR LISTENING !!!