Phát hiện enterovirus 71 bằng phương pháp Real‐time Rt‐pcr

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014  Nghiên cứu Y học Nhiễm 273 PHÁT HIỆN ENTEROVIRUS 71   BẰNG PHƯƠNG PHÁP REAL‐TIME RT‐PCR  Trịnh Thị Hồng*, Hồ Thị Thanh Thủy **, Cao Minh Nga ***  TÓM TẮT  Mở đầu: Enterovirus 71 (EV71) là tác nhân chủ yếu gây nên bệnh Tay‐Chân‐Miệng và thường gây ra các  biến chứng nguy hiểm, có thể dẫn đến tử vong.  Mục tiêu: Xây dựng quy trình phát hiện Enterrovirus 71 bằng phương pháp Real‐time RT‐PCR.  Phương pháp: Thiết kế mồi và mẫu dò dựa trên vùng VP1 của EV71. Tiến hành thực nghiệm bằng  phương pháp Real‐time RT‐PCR trên các mẫu dịch phết, mẫu phân của những bệnh nhân nghi ngờ nhiễm  Tay‐Chân‐ Miệng.  Kết quả: Hệ mồi và mẫu dò Taqman của chúng tôi thiết kế có độ đặc hiệu cao, độ nhạy khoảng 102 bản  sao/phản ứng. Quy trình có thể được sử dụng để phát hiện EV71 trong cả mẫu dịch phết và mẫu phân.  Kết luận: Quy trình Real‐time PCR mà chúng tôi xây dựng có độ nhạy và đặc hiệu cao để phát hiện EV71  từ các mẫu lâm sàng.  Từ khóa: Bệnh Tay‐Chân‐Miệng, Enterovirus 71 (EV71), Real‐time RT‐PCR.  ABSTRACT   DETECTION OF ENTEROVIRUS 71 BY REAL‐TIME RT‐PCR METHOD  Trinh Thi Hong, Ho Thi Thanh Thuy, Cao Minh Nga    * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 ‐ Supplement of No 1 ‐ 2014: 273 ‐ 278  Background: Enterovirus 71 (EV71)  is the main cause of Hand‐Foot‐Mouth Disease (HFMD) and often  cause dangerous complications that can lead to death.  Objectives: To design a procedure for detection EV71 by real‐time PCR.  Methods: Specific primers and Taqman probe were designed based on VP1 region of EV71. Conducting  experiments  by  real‐time  PCR method  on  swab  and  stool  samples  collected  from  pediatric  patients with  suspected HFMD.  Results: Our primer‐probe system that we designed was highly specific. The sensitivity of the method was  102copies/reaction. The procedure can be applied to detection in both swab and stool samples.  Conclutions: Real‐time RT‐PCR method we set up showed a high sensitivity and specificity to detection of  EV71 from clinical specimens.  Keywords: Hand, Foot and Mouth Disease (HFMD), Enterovirus 71 (EV71), Real‐time RT‐PCR.  ĐẶT VẤN ĐỀ  Bệnh Tay‐Chân‐ Miệng  là một bệnh nhiễm  khuẩn  cấp  tính  do  virus  đường  ruột  gây  ra,  thường gặp ở trẻ em dưới 5 tuổi. Bệnh tay‐chân‐ miệng mà do các chủng Enterovirus khác gây nên  thì thường ở thể nhẹ, ít có biến chứng và tự khỏi  trong vòng 1 tuần. Tuy nhiên, nếu do Enterovirus  71 (EV71) thì thường gây ra các biến chứng nguy  hiểm và có thể dẫn đến tử vong nếu không được  phát hiện sớm và xử lí kịp thời.  Sự bùng phát các vụ dịch lớn, nhỏ liên quan  tới EV71 đã được báo cáo trên toàn thế giới kể từ  * Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP. HCM  ** Công ty CP Công nghệ Việt Á   *** Bộ môn Vi Sinh, Khoa Y, Đại học Y Dược TP. HCM  Tác giả liên lạc: PGS.TS. Cao Minh Nga  ĐT: 0908361512 Email : pgscaominhnga@yahoo.com Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Chuyên Đề Nội Khoa 274 đầu những năm 1970. Trong  thập kỷ qua,  tỷ  lệ  mắc bệnh tay chân miệng, đặc biệt  là do nhiễm  EV71, xuất hiện ngày  càng  tăng  trong khu vực  Châu Á Thái Bình Dương(3,4,7). Điều này đã thúc  đẩy các mối quan  tâm  rằng nếu không có biện  pháp can thiệp, nó sẽ tiếp tục lây lan trong khu  vực và toàn cầu.   Hiện nay, bệnh tay chân miệng chưa có vắc  xin phòng  bệnh  và  chưa  có  thuốc  điều  trị  đặc  hiệu. Trong khi  đó EV71  lại  gây  ra nhiều  biến  chứng  nguy  hiểm  nên  việc  xác  định  nhanh  chóng và chính xác EV71 mang một ý nghĩa rất  quan trọng.  Chẩn đoán xác định dựa  trên nuôi cấy mô,  phân lập và phát hiện virus nhưng tốn thời gian  và khó  thực hiện. Do  đó những phương pháp  này không thiết thực cho việc ra quyết định lâm  sàng, đặc biệt trong việc quyết định giữa các can  thiệp  và  điều  trị  ở  những  bệnh  nhân mà  đặc  trưng  lâm  sàng  không  rõ  ràng  hay  thậm  chí  không có. Hiện nay, các xét nghiệm kháng thể và  PCR phổ  biến  rộng  rãi  hơn  và  cho phép  chẩn  đoán  nhanh  hơn  nhưng  chưa  được  sử  dụng  rộng rãi do chi phí cũng như mối quan  tâm về  việc độ nhạy và độ đặc hiệu không đảm bảo(3).  Với mong muốn phát triển một phương pháp có  thể phát hiện nhanh bệnh và điều trị kịp thời với  độ nhạy và đặc hiệu cao hơn so với các phương  pháp  thông  thường,  chúng  tôi  tiến hành  “Xây  dựng quy  trình phát hiện Enterrovirus  71 bằng  phương pháp Real‐time RT‐ PCR ”.  ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU  ‐  Các mẫu  dịch  phết  hầu  họng,  dịch  phết  trực  tràng, mẫu phân nghi ngờ nhiễm  tay chân  miệng  được  cung  cấp bởi Viện vệ  sinh dịch  tễ  Tây Nguyên, Bệnh  viện Hải Phòng, Bệnh  viện  Khánh Hòa.  ‐  Các mẫu  dịch  phết  hầu  họng,  dịch  phết  trực  tràng dương  tính EV71 đã được phát hiện  bằng phương pháp Real‐time RT‐PCR do Bệnh  viện Nhi Đồng 2 cung cấp.  Phương pháp thiết kế mồi và mẫu dò  Mồi và mẫu dò được thiết kế dựa trên vùng  VP1 (vùng bảo tồn cao) của EV71. Sau đó, chúng  tôi dùng  phần mềm  trực  tuyến OligoAnalyzer  (IDT) để kiểm tra và chỉnh sửa các mồi và mẫu  dò cho phù hợp với các tiêu chuẩn (kích thước,%  GC, Tm, các cấu trúc thứ cấp).  Phương pháp tách chiết RNA  Tách  chiết  RNA  theo  phương  pháp  phenol/chloroform  (Sambrook và Russell, 2001)  để  loại  bớt  những  hợp  chất  ức  chế  phản  ứng  real‐time PCR.  Phương pháp RT‐ PCR   Chạy phản ứng RT với 10 μl hỗn hợp RT +  15 μl dịch RNA phiên mã ngược  thành cDNA.  Chương trình luân nhiệt: 25oC trong 5 phút, 42oC  trong 30 phút, 85oC trong 5 phút, giữ ở 4oC.  Phương pháp PCR  Chạy phản ứng PCR với 2,5 μl dịch cDNA từ  phản ứng RT + 12,5 μl Master mix + 0,5 μl mồi  xuôi và mồi ngược + nước Biopure  cho  đủ  thể  tích phản ứng 25 μl/ phản ứng.   Chương  trình  luân  nhiệt:  200C  –  10  phút,  950C – 5 phút; 40 chu kỳ: 940C – 30 giây, 550C –  30 giây, 720C ‐ 30 giây; 1 chu kỳ : 720C – 6 phút.  Giữ ở 40C.  Phương pháp điện di trên gel agarose  Sử dụng kỹ thuật điện di để phân tách các  phân  tử  DNA.  Sự  phát  hiện  được  quan  sát  bằng mắt  thường  dưới  đèn UV  nhờ  sự  phát  màu  của  ethidium  bromide  gắn  xen  trong  DNA.  Dùng  thang  DNA  100bp  làm  thang  chuẩn  để  xác  định  kích  thước  đoạn  DNA  mẫu(1).  Phương pháp real‐time RT‐PCR  2,5µl  cDNA  từ  phản  ứng  RT  +  12,5μl  master mix + 0,5 μl mồi xuôi và mồi ngược +  0,5  μl mẫu dò  +  thêm nước  cất  cho  đủ  25  μl  Sau  đó  tiến  hành  chương  trình  luân  nhiệt  (bảng 1).  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014  Nghiên cứu Y học Nhiễm 275 Bảng 1: Chương trình luân nhiệt  Số chu kỳ Nhiệt độ Thời gian 1 950C 5 phút 40 950C 15 giây 550C 45giây 720C 20 giây Việc  phân  tích  kết  quả  sau  phản  ứng  luân  nhiệt được thực hiện với phần mềm iCycler (Bio‐ rad) theo hướng dẫn sử dụng.  KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN  Kết quả thiết kế hệ mồi và mẫu dò trên  lý thuyết  Theo các tài liệu tham khảo được, các hệ mồi  và mẫu  dò  được  thiết  kế  dựa  trên  kết  quả  so  sánh sự sắp gióng  trình  tự vùng VP1 của EV71  với trình tự của cosxakie virus A16 (CA16)(4,5,7,9).  Trong nghiên cứu này, chúng tôi tham khảo hệ  mồi và mẫu dò  từ nghiên  cứu  của Tan E.L và  Poh C.L (8). Để mồi và mẫu dò bắt cặp tốt hơn với  trình tự mục tiêu, chúng tôi tiến hành thiết kế lại  mồi ngược, chỉnh sửa một số nucleotide  ở mồi  xuôi,  giữ  lại mẫu  dò,  đồng  thời  chúng  tôi  sử  dụng một số nucleotide thay thế: R (A, G) và Y  (C, T) cho cả hệ mồi và mẫu dò.  Để kiểm tra đặc tính của mồi và mẫu dò về  nhiệt  độ  lai,  kích  thước mồi,  các  cấu  trúc  thứ  cấp, chúng tôi sử dụng phần mềm Annhyb và  phần mềm  trực  tuyến oligo Analyzer  3.1  (IDT,  Hoa  Kỳ).  Kết  qủa  cho  thấy:  chiều  dài,  %GC,  nhiệt  độ  lai,  các  cấu  trúc  thứ  cấp  (UG  của  Hairpin,  Self‐Dimer, Hetero)  đều  thỏa  các  yêu  cầu đặt ra về việc thiết kế mồi và mẫu dò.  Bảng 2: Trình tự cặp mồi và mẫu dò thiết kế  Trình tự (5’-3’) Vị trí trên bộ gen (JF738000.1) Mồi xuôi TCAGYAGRGCRGGATTRGTTG 2602 - 2622 Mồi ngược GCATYTGYGCGTAACCTGTTA 2709 - 2689 Mẫu dò AGAYCTCCCTCTTGARGGYACAACYAA 2630 - 2656 Sản phẩm PCR 108 bp Chúng  tôi  sử  dụng  phần  mềm  ClustalX,  Blast, Annhyb để xác định khả năng bắt cặp đặc  hiệu của các mồi và mẫu dò. Kết quả cho thấy:  hệ mồi  và mẫu  dò  bắt  cặp  hoàn  toàn  với  các  trình tự mục tiêu và đặc hiệu cao đối với EV71.  Kết  quả  kiểm  tra  hoạt  động  của  hệ mồi  bằng thực nghiệm   Chạy  thử  hệ mồi  thiết  kế  trên mẫu dương  tính  đã  được  khẳng  định  bằng  phương  pháp  Real‐Time RT‐PCR ở Bệnh viện Nhi Đồng 2 (Kit  tách  chiết:  QIAGEN;  PCR  mix:  One‐step  Invitrogen; Primer/probe:  in  house)  và  kết  quả  cho  thấy: hệ mồi  được  thiết kế hoạt  động hiệu  quả trong phản ứng PCR do chúng tôi thiết lập.  Kết quả giải trình tự sản phẩm PCR  Chúng  tôi  sử dụng kỹ  thuật giải  trình  để  kiểm tra sản phẩm PCR được nhân bản từ cặp  mồi  đã  thiết kế  trên vùng gen VP1 của EV71.  Chúng tôi  lấy sản phẩm PCR gửi đi giải trình  tự  ở  công  ty Macrogen  (Hàn  quốc). Kết  quả  giải  trình  tự  cho  thấy:  hệ mồi  của  chúng  tôi  hoạt động tốt, đặc hiệu và chuyên biệt, có thể  ứng dụng được vào quy trình.  Xây dựng phản ứng Real‐time RT‐ PCR  Kiểm  tra  hoạt  động  của  hệ mồi  và mẫu  dò  trong phản ứng real‐time RT‐PCR   Chúng  tôi  thiết  lập  phản  ứng  Real‐time  PCR với mẫu chứng dương và mẫu chứng âm  với  cặp mồi  ở  nhiệt  độ  là  55oC. Kết  quả  cho  thấy: hệ mồi và mẫu dò cho EV71 có khả năng  nhân bản tốt.  Khảo sát độ đặc hiệu của cặp mồi và mẫu dò  Kết quả hình 1 cho thấy: Hệ mồi và mẫu dò  chỉ nhân bản với EV71 và âm tính với những tác  nhân  khác  (Herpes  simplex  virus,  Neisseria  gonorrhoeae,  Chlamydia  trachomatis,  Mycobacterium  tuberculosis, Adenovirus, Human  papilloma virus). Điều này  chứng  tỏ  trong quá  trình thao tác không bị nhiễm, hệ mồi và mẫu dò  đã thiết kế hoạt động tốt, đặc hiệu với EV71.  Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Chuyên Đề Nội Khoa 276 Hình 1: Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của cặp mồi EV71  Khảo sát nồng độ MgCl2  Nồng  độ MgCl2  được khảo  sát  từ 1,5 mM  đến 5,0 mM với  đơn vị  tăng  là 0,5 mM. Tiêu  chí  đánh  giá  là  chu  kỳ ngưỡng  (Ct). Kết  quả  hình 2 cho thấy: nồng độ MgCl2 = 3,0 mM cho  giá  trị Ct  nhỏ  nhất,  chúng  tôi  chọn  nồng  độ  này để tối ưu cho các phản ứng tiếp theo.  Hình 2: Kết quả khảo sát nồng độ MgCl2  Khảo sát nồng độ mẫu dò Taqman  Chúng  tôi  thiết  lập  bảng  khảo  sát  trên  gradient nồng độ mẫu dò từ 100 đến 500 nM với  đơn vị tăng là 50 nM. Tiêu chí đánh giá của thí  nghiệm là Ct. Kết quả hình 3 cho thấy: nồng độ  mẫu dò = 300nM cho giá trị Ct nhỏ nhất, chúng  tôi chọn nồng độ này để tối ưu cho các phản ứng  tiếp theo.  Hình 3: Kết quả khảo sát nồng độ mẫu dò Taqman  Khảo sát nhiệt độ lai   Chúng  tôi  khảo  sát  nhiệt  độ  bắt  cặp  trong  khoảng  (Tm mồi xuôi + Tm mồi ngược)/2 ± 5oC  với đơn vị tăng 0,5oC. Tiêu chí đánh giá là Ct và  nhiệt độ biến  tính của sản phẩm PCR. Kết quả  hình  4  cho  thấy:  ở  59,5  0C  cho  giá  trị  chu  kỳ  ngưỡng là nhỏ nhất, chúng tôi chọn nhiệt độ này  để tối ưu cho các phản ứng tiếp theo.  Probe 300nM Chứng âm MgCl2 3,0mM Chứng âm HSV, NGN, CHT, MTB, HPV, Adeno Chứng âm EV71 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014  Nghiên cứu Y học Nhiễm 277 Hình 4: Kết quả khảo sát nhiệt độ lai  Khảo sát độ nhạy   Pha loãng bậc 10 liên tiếp mẫu ban đầu (đã  biết trước nồng độ) thành nhiều nồng độ khác  nhau. Ở mỗi nồng độ,  tiến hành khảo sát với  những  điều  kiện  tối  ưu  đã  được  khảo  sát  từ  các thí nghiệm trên. Từ đó sẽ xác định nồng độ  nhỏ nhất mà phương pháp có thể phát hiện và  vẫn  cho  kết  quả  chính  xác,  rõ  ràng. Kết  quả:  giới  hạn  phát  hiện  của  quy  trình  là  102  bản  sao/phản ứng (hình 5).  Hình 5: Khảo sát độ nhạy của quy trình   Khảo  sát  hệ  số  tuyến  tính  của  đường  chuẩn  (standard curve)   Chúng tôi xây dựng đường chuẩn cho phản  ứng  định  lượng EV71,  từ đường  chuẩn này  có  thể xác định được hàm  lượng virus  trong bệnh  phẩm. Hệ số tuyến tính của đường chuẩn qua ba  lần thực nghiệm đều bằng 1, hiệu quả khuyếch  đại  từ 95,9% đến 97,2%. Qua đó cho  thấy phản  ứng real‐time PCR của chúng tôi là hiệu quả và  đạt mức độ tối ưu.  Khảo  sát  tính  lặp  lại  của  phản  ứng  Real‐ Time PCR   Khảo sát hệ số biến thiên nội phản ứng và hệ  số  biến  thiên  liên  phản  ứng  trên  mẫu  chuẩn  EV71 với các nồng độ 102, 104, 106 bản sao/phản  ứng và hai mẫu bệnh phẩm. Phản ứng được lặp  lại ba lần. Kết quả: hệ số biến thiên nội phản ứng  real‐time RT‐PCR EV71 nằm  trong khoảng 0,54  đến 1,35 và hệ số biến thiên liên phản ứng nằm  trong khoảng 1,4 đến 2,0.  Ứng dụng quy trình trên các mẫu bệnh phẩm   Tiến hành khảo sát trên 74 mẫu bệnh phẩm  với các thông số đã tối ưu ở các thí nghiệm trên.  Kết  quả  khảo  sát  trên  74 mẫu: Có  40 mẫu  nhiễm EV71,  trong  đó  có  10 mẫu  (5 mẫu dịch  phết  họng  và  5 mẫu  dịch  phết  trực  tràng)  đã  được  đối  chiếu  với  kết  quả  xét  nghiệm  cũng  bằng phương pháp Real‐time RT‐ PCR bằng kít  của hãng QIAGEN (Đức) thì thấy hoàn toàn phù  hợp.  Điều  này  chứng  tỏ  quy  trình  phát  hiện  59,5 oC Chứng âm m Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Chuyên Đề Nội Khoa 278 EV71  trong  các  mẫu  dịch  phết  và  mẫu  phân  bằng  phương  pháp  Real‐time  RT‐  PCR  của  chúng  tôi xây dựng  có khả năng  ứng dụng  để  phát hiện EV71 trong các mẫu nhiễm.  KẾT LUẬN  ‐  Chúng  tôi  đã  xây  dựng  thành  công  quy  trình phát hiện EV71 bằng Real‐time RT‐PCR với  độ nhạy là 102 copies/ml, độ đặc hiệu cao, nhiệt  độ  lai  tối  ưu  của  quy  trình  là  59,50C, nồng  độ  mẫu dò Taqman là 300nM.  ‐ Quy  trình đã được ứng dụng để khảo sát  trên 74 mẫu bệnh phẩm, trong đó có 40/74 mẫu  cho kết quả dương tính với EV71.  TÀI LIỆU THAM KHẢO  1. Cao Minh Nga  (2008). Ứng dụng sinh học phân  tử  trong chẩn  đoán  bệnh  nhiễm  trùng  (Tài  liệu  tập  huấn).  Bộ  Y  Tế.  Viện  Pasteur TP. HCM.  2. REDI (2009). Forum on Hand Foot and Mouth Disease (HFMD) in  Asia‐Pacific Region, Ministry of Health Singapore.   3. REDI (2011). A Guide to Clinical Management and Public Health  Response  for  Hand,  Foot  and  Mouth  Disease,  World  Health  Organization.   4. Singh  S,  et  al  (2000).  “RT‐PCR,  nucleotide,  amino  acid  and  phylogenetic  analyses  of  enterovirus  type  71  strains  from  Asia”. J. Virol. Methods, 88:193–204.   5. Singh S, et al (2002). “Direct detection of enterovirus 71 (EV71)  in  clinical  specimens  from  a  hand,  foot  and mouth disease  outbreak  in  Singapore  by  reverse  transcription‐PCR  with  universal  enterovirus  and  EV71‐specific  primers”,  J.  Clin.  Microbiol, 40 (8), p. 2823 – 2827.   6. Solomon  T,  et  al  (2010).  “Virology,  epidemiology,  pathogenesis, and control of enterovirus 71”, Lancet Infect Dis,  10: 778–90.   7. Tan  EL, Yong  LL, Quak  SH, Yeo  WC, Chow  VT, Poh  CL  (2008).  “Rapid  detection  of  Enterovirus  71  by  real‐time  TaqMan RT‐PCR”, Journal of Clinical Virology, p. 203–206.   8. Tan EL  and Poh CL  (2010).  “Development  of TaqMan  and  Hybridisation Probes for detection of Enterovirus 71 (EV71)”.  National University of Singapore.  9. Tsang  WS  and  Poh  CL  (2010).  “Rapid  Identification  of  Enterovirus  71  (EV71)  by Real‐Time Reverse  Transcription‐ Polymerase  Chain  Reaction  (RT‐PCR)  with  EV71  Specific  Primers”. National University of Singapore.  Ngày nhận bài báo: 07/11/2013  Ngày phản biện nhận xét bài báo: 28/11/2013  Ngày bài báo được đăng: 05/01/2014