QUANG SINH HỌC

Chương 8 QUANG SINH HỌC I. Bản chất của ánh sáng Ánh sáng là bức xạ điện từ trường lan truyền trong không gian với vận tốc vô cùng lớn (trong chân không vận tốc ánh sáng đạt 300.000km/s). Ánh sáng được chia thành 3 vùng cơ bản: • Vùng nhìn thấy (vùng khả kiến) có bước sóng (λ) từ 400 → 700nm • Vùng tử ngoại có λ = 200nm → 400nm • Vùng hồng ngoại có λ = 700nm → 1000nm Trong hệ sinh vật, các loài có vùng khả kiến không giống nhau. Ví dụ với người vùng khả kiến có λ = 400nm → 700nm nhưng với côn trùng, vùng khả kiến lại có λ = 320nm → 500nm. Ánh sáng vừa có tính sóng (đặc trưng bởi bước sóng và tần số...) vừa có tính chất hạt (đặc trưng bởi các lượng tử ánh sáng hay còn gọi là photon). Photon có khối lượng nhỏ hơn khối lượng của điện tử khoảng 1 triệu lần (khối lượng photon bằng 1,785.10-27gam). Mỗi photon có mang một giá trị năng lượng được tính theo công thức: γ= .hE Hoặc λ= v.hE (8.1) E: Năng lượng của photon γ : Tần số ánh sáng bằng số dao động ánh sáng trong 1 giây v: Vận tốc ánh sáng bằng 300.000km/s λ: Bước sóng ánh sáng h: Hằng số Planck bằng 6,62.10-27erg.s Đơn vị dùng xác định năng lượng photon là electron vôn (hay điện tử vôn), ký hiệu là eV hoặc Kcal. Một điện tử vôn là năng lượng cần thiết cung cấp cho 1 điện tử đi qua thế hiệu một vôn với khoảng cách giữa hai điện cực là 1Cm. Công thức chuyển đổi giữa các đơn vị đo năng lượng: 1eV=1,602.10-12erg và 1 Kcal=4,2.1010erg Thay giá trị hằng số Planck và vận tốc ánh sáng vào công thức (8.1) sẽ tính được năng lượng của photon có bước sóng tính theo: )eV( )nm( 1244E λ= (8.2) Nếu quan niệm một photon tương tác với một phân tử thì để chuyển một phân tử gam vật chất (1M) chứa 6,023.1023 phân tử lên trạng thái kích thích cần có 6,023.1023 photon, gọi là cần cung cấp một mol lượng tử (hay một Einstein). Năng lượng của một mol lượng tử tính theo đơn vị Kcal được tính theo công thức: )nm( 650.28E λ= (Kcal/M) (8.3) Từ các công thức trên thấy rằng năng lượng của ánh sáng tỷ lệ thuận với tần số ánh sáng ( γ ) còn tỷ lệ nghịch với bước sóng ánh sáng (λ). Năng lượng ánh sáng có bước sóng ngắn lớn hơn năng lượng ánh sáng có bước sóng dài. Ví dụ năng lượng tia tử ngoại có bước sóng λ=200nm, có giá trị 143,25Kcal/M còn ánh sáng khả kiến có λ=750nm chỉ đạt 38,2Kcal/M. II. Qui luật hấp thụ ánh sáng Sự hấp thụ ánh sáng của vật chất được biểu hiện ở chỗ cường độ ánh sáng bị yếu đi sau khi xuyên qua lớp vật chất nghiên cứu. Năm 1760, Lambert và sau đó năm 1852, Beer đã tìm ra qui luật hấp thụ ánh sáng bởi vật chất. Sự biến đổi cường độ ánh sáng (ký hiệu là dI) khi đi qua lớp mỏng vật chất (ký hiệu là dl) sẽ tỷ lệ với cường độ ánh sáng chiếu (ký hiệu là I) và nồng độ (ký hiệu là C) cũng như hệ số k, đặc trưng cho khả năng hấp thụ của vật chất. Biểu thức toán học của định luật Lambert - Beer có thể viết như sau: Chùm sáng tới Chùm sáng ló Io C l I Hình 8.1: Ánh sáng truyền qua dung dịch có nồng độ C và chiều dày l. dl dI− = k.I.C (8.4) Dấu trừ biểu thị sự hấp thụ ánh sáng bởi vật chất. Phương trình (8.4) có thể viết dưới dạng: I dI = -k.C.dl (8.5) Lấy tích phân vế trái theo cường độ ánh sáng từ Io đến I và vế phải theo chiều dày từ O đến l ta được: ∫ ∫−= I I l Oo dl.C.k I dI l.C.kIln I Io −= lnI - lnIo = -k.C.l (8.6) l.C.k Io Iln −= (8.7) I = Io kCle− (8.8) Io: Cường độ ánh sáng tới I: Cường độ ánh sáng ló C: Nồng độ vật chất k: Hệ số hấp thụ l: Chiều dày vật chất (tính theo Centimet) Công thức (8.6) có thể viết dưới dạng: lnIo - lnI = k.C.l I I ln o = k.C.l (8.9) Đặt I I lnD o= , gọi là mật độ quang học của dung dịch. Khi đó công thức (8.9) có thể viết như sau: D = k.C.l (8.10) Từ công thức (8.10) suy ra rằng: mật độ quang học của dung dịch tỷ lệ thuận với nồng độ dung dịch và chiều dày của lớp vật chất mà ánh sáng truyền qua. Khi l = 1Cm thì mật độ quang học (D) tỷ lệ thuận với nồng độ dung dịch (C), thể hiện trên hình 8.2. D D3 D2 D1 O C1 C2 C3 C Khi nồng độ dung dịch C = 1M và l = 1Cm thì từ (8.10) suy ra D = k. Như vậy, hệ số hấp thụ chính bằng mật độ quang học của dung dịch có chiều dày 1Cm và nồng độ 1M. Hình 8.2: Sự phụ thuộc của D vào C Công thức (8.10) được áp dụng để tính mật độ quang học của hệ đồng nhất (là hệ không có ranh giới phân chia ra các phần có nồng độ khác nhau). Đối với hệ dị thể như hệ sinh vật, có nhiều phần có nồng độ chất khác nhau thì mật độ quang học của toàn hệ sẽ bằng tổng mật độ quang học của từng thành phần riêng rẽ theo công thức sau: D = D1 + D2 + D3 + ... Dn (8.11) D: Mật độ quang học của hệ D1, D2, D3 ... Dn: Mật độ quang học của lớp 1, 2, 3... lớp n. Để đánh giá phần trăm lượng ánh sáng mà mẫu vật đã hấp thụ, người ta đưa vào khái niệm độ truyền qua, ký hiệu là T, được tính theo công thức: oI IT = (8.12) T: Độ truyền qua (đơn vị là %) Io: Cường độ ánh sáng tới I: Cường độ ánh sáng ló Khi mẫu vật hấp thụ ánh sáng hoàn toàn, tức I=0 thì T=0. Nếu mẫu vật hoàn toàn không hấp thụ ánh sáng, tức I=Io thì T=1 (hay 100%). Lượng ánh sáng hệ hấp thụ được tính theo công thức: Ih = Io- I (8.13) Ih: Cường độ ánh sáng đã bị hệ hấp thụ Io: Cường độ ánh sáng tới I: Cường độ ánh sáng ló Từ (8.12) có I = Io .T và thay I vào (8.13) ta được: Ih = Io - (Io.T) = Io(1-T) → o h I I = 1 - T (8.14) Tỷ số o h I I gọi là độ hấp thụ. Khi mẫu vật hoàn toàn không hấp thụ ánh sáng, tức T=1 thì độ hấp thụ bằng không. Nếu mẫu vật hấp thụ hoàn toàn ánh sáng, tức T=0 thì độ hấp thụ bằng một. Các giá trị mật độ quang học (D), độ truyền qua (T), độ hấp thụ ⎟⎟⎠ ⎞ ⎜⎜⎝ ⎛ o h I I được đo trên máy quang phổ kế. Trên thực tế, thường sử dụng phương pháp xác định quang phổ hấp thụ của vật chất. Phương pháp này đo sự phụ thuộc của mật độ quang học (D) vào bước sóng (λ) hay tần số (γ) của ánh sáng chiếu. Mỗi chất có một quang phổ hấp thụ đặc trưng riêng. Tức là, mỗi chất chỉ hấp thụ cực đại ở một số bước sóng nhất định. Ví dụ quang phổ hấp thụ của một số phân tử sinh học quan trọng: - Quang phổ hấp thụ của protein đạt giá trị cực đại ở bước sóng λ=280nm. - Quang phổ hấp thụ của carotin đạt giá trị cực đại ở bước sóng λ=480nm. - Quang phổ hấp thụ của rodopxin đạt giá trị cực đại ở bước sóng λ=550nm. - Quang phổ hấp thụ của diệp lục a đạt giá trị cực đại ở hai bước sóng λ1=440nm và λ2=700nm. - Mắt người có thể phân biệt được 300 màu sắc khác nhau nhưng chủ yếu hấp thụ ba màu cơ bản là màu đỏ (có λ=600nm), màu xanh (có λ=550nm) và màu da cam (có λ=450nm). III. Các giai đoạn cơ bản của quá trình quang sinh học Các quá trình quang sinh học thường được đánh giá theo hai quan điểm sau: - Quan điểm một là những phản ứng mà các sản phẩm cuối cùng của nó có dự trữ năng lượng cao hơn so với năng lượng của các chất ban đầu tham gia vào phản ứng, được gọi là những phản ứng tạo năng lượng. Ví dụ như quá trình quang hợp ở thực vật. - Quan điểm hai là các phản ứng quang sinh học trong đó ánh sáng đóng vai trò là nguồn năng lượng hoạt hóa các phân tử khi tham gia vào phản ứng hóa sinh hoặc là dưới tác dụng của ánh sáng đã dẫn tới các phản ứng phá hủy biến tính ở mức độ phân tử, tế bào, mô hay cơ thể. Xét theo quan điểm nào, quá trình quang sinh học cũng đều trải qua những giai đoạn nối tiếp nhau như sau: 1. Hấp thụ lượng tử ánh sáng bởi các sắc tố hoặc tế bào (như tế bào que, tế bào nón) gây nên trạng thái hưng phấn hay còn gọi là trạng thái kích thích. 2. Khử trạng thái kích thích điện tử của phân tử. Giai đoạn này xảy ra các quá trình sau: - Thải hồi năng lượng qua các quá trình quang lý (như phát huỳnh quang hay lân quang). - Thải hồi năng lượng qua các quá trình quang hóa dẫn tới hình thành nên những sản phẩm quang hóa không bền vững đầu tiên. Đối với quá trình quang hợp đó là các sản phẩm NADPH và ATP. - Thải hồi năng lượng bằng cách tỏa nhiệt ra môi trường. 3. Diễn ra các phản ứng trung gian không cần tới sự chiếu sáng (gọi là phản ứng tối) với sự tham gia của các sản phẩm quang hóa không bền vững nói trên để tạo thành sản phẩm quang hóa bền vững (với quá trình quang hợp, đó là hydratcacbon). 4. Hiệu ứng sinh học cuối cùng như các biểu hiện sinh lý cảm nhận màu sắc, sự vật, sự sinh trưởng và phát triển v.v... Giai đoạn hấp thụ lượng tử ánh sáng và giai đoạn khử trạng thái kích thích điện tử của phân tử, đặc trưng chung cho tất cả các phản ứng quang sinh vật (xem hình 8.3). S2 (Singlet 2) S1 (Singlet 1) T (Triplet) So (Singlet) A a 4 1 3 2 c b Hình 8.3: Sơ đồ biểu diễn các mức năng lượng của phân tử và các bước chuyển giữa các mức năng lượng đó. - Đường a, A khi phân tử hấp thụ năng lượng ánh sáng để chuyển từ mức năng lượng cơ bản ban đầu là So lên mức năng lượng cao hơn là S1 hoặc S2. - Theo cơ học lượng tử thì không có bước chuyển phát xạ (tức phát ra sóng ánh sáng) khi phân tử chuyển từ mức S2 về mức So và cũng không có bước chuyển thẳng từ mức So lên mức triplet (gọi là bước cấm). - Khi phân tử chuyển từ mức S1 về mức cơ bản So sẽ phát huỳnh quang (đường b) hoặc chuyển từ mức triplet về mức cơ bản So sẽ phát lân quang (đường c). - Các đường 1, 2, 3, 4, là phân tử thải hồi năng lượng dưới dạng tỏa nhiệt ra môi trường. Quá trình phân tử hấp thụ năng lượng ánh sáng để chuyển lên trạng thái kích thích và sau đó trở về trạng thái ban đầu, là một quá trình bất thuận nghịch. IV. Sự phát quang Phân tử sau khi hấp thụ năng lượng ánh sáng để chuyển lên trạng thái kích thích có mức năng lượng là S1 hoặc S2 đều có giá trị lớn hơn mức năng lượng ban đầu của phân tử là So. Trong khoảng 10-13 giây, phân tử ở mức năng lượng E2 phải giải phóng một phần năng lượng dư thừa qua con đường thải nhiệt ra môi trường để trở về trạng thái kích thích có mức năng lượng thấp hơn là S1 (con đường 1 ở hình 8.3). Khi phân tử ở mức năng lượng S1 nó sẽ trở về mức năng lượng cơ bản So qua các con đường sau: Quá trình tỏa nhiệt (đường 2, 3, 4 trên hình 8.3) Phát huỳnh quang (đường b trên hình 8.3) S1 Phát lân quang (đường c trên hình 8.3) Vận chuyển năng lượng Cung cấp năng lượng cho các phản ứng quang hóa 1. Sự phát huỳnh quang Khi các phân tử chuyển từ trạng thái kích thích có mức năng lượng thấp nhất là S1 xuống trạng thái cơ bản là So thì sẽ phát ra ánh sáng huỳnh quang. Sự phát ra ánh sáng huỳnh quang có thể biểu diễn dưới dạng: S1 → So + hγ' γ': Tần số ánh sáng huỳnh quang ⎟⎠ ⎞⎜⎝ ⎛ λ=γ ' v' v: Vận tốc ánh sáng; λ': Bước sóng huỳnh quang Thời gian phân tử dừng ở trạng thái singlet S1 là từ 10-9 đến 10-8 giây, cho nên cũng được xem là thời gian kéo dài của sự phát ra ánh sáng huỳnh quang. Do vậy, sự phát huỳnh quang chỉ xảy ra trong thời gian chiếu sáng mẫu vật, còn khi ngừng chiếu sáng thì sự phát huỳnh quang sẽ tắt. Đặc trưng của ánh sáng huỳnh quang là phổ huỳnh quang. Phổ huỳnh quang là đường cong phụ thuộc của cường độ huỳnh quang vào bước sóng ánh sáng huỳnh quang (λ'). Để nghiên cứu phổ huỳnh quang, các nhà nghiên cứu dùng hệ thống các kính lọc, được bố trí theo sơ đồ sau: 1 3 2 4 hγ', hγ Hình 8.4: Sơ đồ ghi phổ huỳnh quang. 1) Kính lọc chỉ cho ánh sáng có λ mà dung dịch nghiên cứu hấp thụ (với dung dịch protein thì λ = 280 nm) đi qua. 2) Dung dịch nghiên cứu phổ huỳnh quang (dung dịch protein). 3) Kính lọc chỉ cho ánh sáng huỳnh quang do phân tử chất nghiên cứu phát ra. 4) Máy ghi phổ huỳnh quang. Sự phát huỳnh quang tuân theo các qui luật sau: * Qui luật Stock: Phổ huỳnh quang luôn dịch chuyển về phía bước sóng dài hơn so với điểm hấp thụ cực đại của phổ hấp thụ. Bởi vì phân tử hấp thụ năng lượng ánh sáng kích thích có E = h.γ = h. λ v (đường A trên hình 8.3) đã mất một phần năng lượng do thải nhiệt (đường 1 trên hình 8.3) để trở về mức S1 và khi chuyển về mức So đã phát ra ánh sáng huỳnh quang có năng lượng E' = hγ' = h. ' v λ . Ở đây E > E' nên λ < λ', tức là năng lượng ánh sáng kích thích lớn hơn năng lượng ánh sáng huỳnh quang nên bước sóng ánh sáng kích thích ngắn hơn so với bước sóng ánh sáng huỳnh quang. Ví dụ chiếu dung dịch protein ánh sáng kích thích có λ=280nm thì các phân tử protein sẽ phát ra ánh sáng huỳnh quang có bước sóng dài hơn là λ=340nm. * Qui luật Vavilốp: Sự phát ra ánh sáng huỳnh quang của một chất nào đó (chẳng hạn Chlorophyll) không phụ thuộc vào bước sóng ánh sáng kích thích vì ánh sáng huỳnh quang được phát ra khi phân tử chuyển từ mức năng lượng S1→So. Khi phân tử hấp thụ năng lượng ánh sáng để chuyển lên các mức năng lượng cao hơn S1, qua con đường thải nhiệt để cuối cùng đều chuyển về mức S1 để sau đó phát ánh sáng huỳnh quang. Ví dụ Chlorophyll có thể hấp thụ cả ánh sáng xanh (λ=440nm) và ánh sáng đỏ (λ=700nm) nên khi chiếu dung dịch Chlorophyll dù là ánh sáng xanh hay ánh sáng đỏ thì phổ huỳnh quang của Chlorophyll vẫn không thay đổi. * Qui luật Levin: Phổ hấp thụ và phổ huỳnh quang đối xứng quanh một bước sóng λo (xem hình 8.5). Qui luật đúng với phân tử có cấu trúc đơn giản. 1 2 λ1 λo λ2 λ D Hình 8.5: Phổ hấp thụ (1) và phổ huỳnh quang (2) đối xứng qua λo 2. Sự phát lân quang Khi phân tử hấp thụ năng lượng ánh sáng để chuyển từ mức năng lượng cơ bản So lên mức kích thích S1 và khi trở về trạng thái ban đầu có thể bằng sự thải nhiệt (đường 2, hình 8.3) hoặc phát huỳnh quang (đường b, hình 8.3), hoặc thải nhiệt để chuyển về mức triplet (đường 3, hình 8.3), sau đó phân tử chuyển từ mức triplet về mức So và phát ra ánh sáng lân quang (đường c, hình 8.3). Sự phát lân quang có thể biểu diễn dưới dạng: T→So+hγ* γ*: Tần số ánh sáng lân quang ⎟⎠ ⎞⎜⎝ ⎛ λ=γ * * v . Lân quang cũng được đặc trưng bởi phổ lân quang. Phổ lân quang là đường cong phụ thuộc của cường độ ánh sáng lân quang vào bước sóng ánh sáng lân quang (λ*). Phổ lân quang luôn dịch chuyển về phía ánh sáng có bước sóng dài hơn so với phổ hấp thụ và phổ huỳnh quang. Nguyên do vì *lq ' hqht v.hE ' v.hEv.hE λ=>λ=>λ= suy ra bước sóng ánh sáng hấp thụ (λ) nhỏ hơn bước sóng ánh sáng huỳnh quang và bước sóng ánh sáng huỳnh quang (λ') lại nhỏ hơn bước sóng ánh sáng lân quang (λ*) (xem hình 8.6). Sự phát lân quang kéo dài từ 10-4 đến 10-2 giây, tức là lâu hơn so với sự phát huỳnh quang. Do vậy khi đã tắt ánh sáng chiếu nhưng sự phát lân quang vẫn có thể xảy ra. 1 2 λ λ' λ D 3 λ* Hình 8.6: Phổ hấp thụ (1), phổ huỳnh quang (2) và phổ lân quang (3) (λ<λ'<λ*). 3. Sự vận chuyển năng lượng Phân tử hấp thụ năng lượng ánh sáng đã chuyển từ mức năng lượng thấp là So lên mức năng lượng cao là S1. Khi phân tử chuyển từ mức năng lượng S1→So, nó có thể qua con đường thải nhiệt, phát huỳnh quang hay lân quang, hoặc nó có thể chuyền năng lượng cho phân tử khác. Giả sử phân tử ở trạng thái kích thích là chất cho năng lượng (ký hiệu là ) còn chất nhận năng lượng là phân tử ở trạng thái cơ bản (ký hiệu là M*1M o) thì quá trình chuyền năng lượng có thể viết dưới dạng: +M*1M o→M1+ *0M * 0M là phân tử ở trạng thái kích thích và có mức năng lượng cao hơn so với năng lượng của phân tử Mo. Quá trình chuyền năng lượng là một quá trình vật lý, không kèm theo sự biến đổi hoá học và không cần M1 va chạm với Mo. Sự chuyền năng lượng có thể xảy ra theo nhiều cơ chế nhưng ở đây chỉ xét cơ chế chuyền năng lượng theo cộng hưởng cảm ứng. Để có sự chuyền năng lượng theo cơ chế này cần có một số điều kiện sau: - Chất cho năng lượng phải có khả năng phát huỳnh quang, đặc trưng bởi cường độ phát quang là J. * 1M - Phổ huỳnh quang của chất cho phải có vùng chung với phổ hấp thụ của chất nhận M * 1M o (xem hình 8.7), đặc trưng bởi mật độ quang học là D. J D λ - Khoảng cách giữa chất cho và chất nhận năng lượng M * 1M o phải nhỏ hơn giá trị tới hạn cho phép. Ở một số điều kiện khi khoảng cách trung bình giữa chất cho và chất nhận năng lượng đạt khoảng cách từ 20 đến 100 thì có thể chuyền toàn bộ năng lượng cho M o A *1M o, tức là hiệu suất chuyển năng lượng bằng một (ϕ=1). Với hệ có chứa nhiều phân tử có khả năng hấp thụ ánh sáng để chuyển lên trạng thái kích thích thì khả năng xảy ra sự chuyền năng lượng đối với phân tử protein đạt chỉ vài phần trăm còn axit nucleic đạt 30% J D Hình 8.7: Phổ phát quang của chất *1M là J và phổ hấp thụ của chất Mo là D có vùng chung (phần gạch ngang) và ở hệ có nhiều phân tử hấp thụ ánh sáng thì có thể đạt tới 100%. V. Phản ứng quang hóa Phản ứng quang hóa là những phản ứng xảy ra trong hệ dưới tác dụng của ánh sáng. Phản ứng quang hóa nào cũng đều trải qua hai giai đoạn. Giai đoạn đầu là giai đoạn được chiếu sáng đã xảy ra sự hấp thụ năng lượng ánh sáng để tạo nên những phân tử bị kích thích, các ion và các gốc tự do. Giai đoạn thứ hai là giai đoạn tối (không cần sự chiếu sáng) tiếp tục xảy ra các phản ứng với sự tham gia của các sản phẩm quang hóa được hình thành từ giai đoạn sáng để tạo nên sản phẩm quang hóa bền vững. Tốc độ phản ứng quang hóa được xác định bằng nồng độ phân tử chất tham gia vào phản ứng trong một đơn vị thời gian (ký hiệu là dt dC ). Phân tử chỉ có thể tham gia vào phản ứng khi đã hấp thụ lượng tử ánh sáng để chuyển lên trạng thái kích thích (tức đã được hoạt hóa). Do vậy, tốc độ phản ứng quang hóa phải bằng số lượng tử ánh sáng được hấp thụ trong một đơn vị thời gian (ký hiệu là dt dN ). Từ đó có phương trình: dt dN dt dC = (8.15) Số lượng tử ánh sáng được hấp thụ trong một đơn vị thời gian tỉ lệ thuận với số lượng tử ánh sáng chiếu vào hệ (ký hiệu là I), nồng độ phân tử chất hấp thụ (C) và tiết diện bề mặt bị chiếu sáng (S). Từ đó có phương trình: dt dN = S.C.I (8.16) Từ (8.15) suy ra: dt dC = S.C.I (8.17) Tuy nhiên, không phải tất cả năng lượng photon đều được các phân tử hấp thụ để chuyển lên trạng thái kích thích và sau đó phân tử kích thích tiếp tục tham gia vào phản ứng mà có một số phân tử kích thích không tham gia vào phản ứng mà trở về trạng thái ban đầu bằng cách thải nhiệt ra môi trường hay phát quang. Vì thế có khái niệm hiệu suất quang hóa (hay suất lượng tử, ký hiệu là ϕ) được xác định theo công thức: Số photon được phân tử hấp thụ để tham gia vào phản ứng (N2) ϕ = Số photon được hệ hấp thụ (N1) Hay: 1 2 N N=ϕ (8.18) Trên thực tế giá trị ϕ bao giờ cũng nhỏ hơn 1 và chỉ đạt vài phần trăm đến vài chục phần trăm. Ví dụ như hiệu suất quang hóa của phản ứng khử hoạt tính của men khi bị chiếu sáng chỉ đạt từ 10-3 đến 10-2 (tức từ 1 000 →1%), nghĩa là một phân tử men phải hấp thụ từ 100 đến 1000 photon mới bị mất hoạt tính xúc tác. Sở dĩ hiệu suất quang hóa có giá trị thấp như vậy là do chỉ có một số ít phân tử sau khi hấp thụ photon đã tham gia vào phản ứng. Từ đó dẫn tới khái niệm tiết diện quang sinh (δ) và được cho rằng chỉ khi photon đập trúng tiết diện quang sinh của phân tử mới dẫn tới phân tử tham gia vào phản ứng. Bây giờ hiệu suất quang hóa được tính theo công thức: S δ=ϕ (8.19) δ < S → ϕ < 1 Phương trình (8.17), thay khái niệm tiết diện bề mặt bị chiếu sáng bằng tiết diện quang sinh sẽ được viết dưới dạng: dt dC = - δ.C.I (8.20) Dấu trừ biểu hiện nồng độ phân tử kích thích khi tham gia vào phản ứng quang hóa sẽ giảm dần theo thời gian. Phương trình (8.20) có thể viết dưới dạng: C dC = - δ.I.dt (8.21) Nếu lấy thời gian bắt đầu xảy ra phản ứng quang hóa là không giây, ứng với nồng độ ban đầu của các phân tử tham gia vào phản ứng quang hóa là Co thì sau thời gian là t, số phân tử kích thích chưa tham gia vào phản ứng là C. Lấy tích phân hai vế (8.21) ta có: ∫ δ−=C C t Oo dtI. C dC ∫ → oC Cln = - δ.I.t t.I.o t.I. o e.CCe C C δ−δ− =→= (8.22) Nồng độ phân tử kích thích tham gia vào phản ứng quang hóa sẽ giảm dần theo thời gian. Để đánh giá tốc độ phản ứng quang hóa có phụ thuộc vào bước sóng ánh sáng chiếu (λ), người ta đo tốc độ phản ứng quang hóa ⎟⎠ ⎞⎜⎝ ⎛ dt dC ở những bước sóng khác nhau nhưng có cùng một cường độ ánh sáng là I (tức là cùng số lượng tử ánh sáng chiếu vào mẫu vật). Khi đó giá trị dt dC /I sẽ phụ thuộc vào bước sóng ánh sáng chiếu được gọi là đo quang phổ hoạt động của phản ứng quang hóa. Quang phổ hoạt động của phản ứng quang hóa có dạng trùng với quang phổ hấp thụ của các phân tử đã tham gia vào phản ứng quang hóa. Ví dụ: Trong quang phổ hoạt động của quá trình quang hợp, xuất hiện đỉnh cực đại ở vùng bước sóng 480nm - 500nm mà carotin cũng có đỉnh hấp thụ cực đại tại vùng bước sóng này, chứng tỏ carotin có tham gia vào quá trình quang hợp. Hoặc khi chiếu ánh sáng lên dung dịch men thể hiện phổ hoạt động của phản ứng quang hóa dẫn tới khử hoạt tính men trùng với phổ hấp thụ của axit amin thơm. Điều này chứng tỏ axit amin thơm trong thành phần cấu tạo của phân tử men đã tham gia vào phản ứng quang hóa nên dẫn tới làm cho phân tử men bị mất hoạt tính xúc tác. Nếu chất A hấp thụ năng lượng ánh sáng nhưng tham gia vào phản ứng quang hóa lại là chất B thì phổ hoạt động và phổ hấp thụ của chất B phải trùng nhau. Như vậy có nghĩa là chất A đã chuyền năng lượng cho chất B (A+hγ→A*→B→B*) để chất B chuyển lên trạng thái kích thích (B*) và tham gia vào phản ứng quang hóa. Nếu trong hệ có nhiều chất, khi chiếu sáng và nghiên cứu phổ hoạt động, sau đó so sánh với phổ hấp thụ của những chất đã biết sẽ xác định được chất nào đã chuyền năng lượng (nên không có phổ hoạt động) và chất nào đã tham gia vào phản ứng quang hóa (nên có phổ hoạt động). VI. Phương pháp đo độ hấp thụ trong vùng ánh sáng trông thấy và tử ngoại Khi đo độ hấp thụ, các nhà nghiên cứu hay dùng máy quang phổ kế (còn gọi là máy so màu). Sơ đồ cấu tạo máy quang phổ kế được mô tả trên hình 8.8. 1 2 3 4 5 0 Hình 8.8: Sơ đồ cấu tạo máy quang phổ kế 1) Nguồn chiếu sáng 2) Kính lọc bước sóng ánh sáng 3) Cốc đựng mẫu (cuvét) 4) Tế bào quang điện 5) Màn hình thiết bị đo giá trị mật độ quang học (D) hay độ truyền qua (T) Nguyên tắc đo: Cho dung môi (chất dùng để pha dung dịch nghiên cứu) vào ống thủy tinh số 3 và chỉnh thiết bị đo số 5, cho kim chỉ số không. Sau đó đổ dung môi ra, tráng sạch, sấy khô, để nguội rồi đổ dung dịch nghiên cứu vào, trên màn hình thiết bị đo số 5, kim sẽ chỉ giá trị mật độ quang học D hay độ truyền qua T. Lưu ý cả dung môi và dung dịch nghiên cứu đều đo ở bước sóng đã được chọn trước. Ví dụ đo mật độ quang học của dung dịch ADN thì phải chọn bước sóng λ=260nm. Mỗi chất hấp thụ cực đại ở một bước sóng nhất định (ký hiệu là λmax) và khi chiếu ánh sáng λmax, đối với mỗi chất có một hệ số hấp thụ xác định (ký hiệu là kmax). Song cũng có những chất hấp thụ cực đại ở một số bước sóng khác nhau như triptophan, tirozin, phenilalanin và do vậy chúng cũng có các hệ số hấp thụ tương ứng (xem bảng 8.1). Bảng 8.1: Độ hấp thụ và hệ số hấp thụ ở bước sóng λmax. Các chất λmax (nm) kmax Tirozin 274; 222; 193 (1,4; 8; 48).10-3 Phenilalanin 257; 206; 188 (0,2; 9,3; 60).10-3 Triptophan 280; 219 (5,6; 47).10-3 Hixtidin 211 5,9.10-3 Xistein 250 0,3.10-3 Adenin 260,5 13,4.10-3 Adenozin 259,5 14,9.10-3 Guanozin 252,5 13,6.10-3 Guanin 246 10,7.10-3 Xitozin 267 6,1.10-3 Xitidin 271 9,1.10-3 Uraxin 261,1 10,1.10-3 Timin 264,5 7,9.10-3 Timidin 267 9,7.10-3 ADN 260 6,6.10-3 ARN 258 7,4.10-3 Phương pháp đo quang phổ hấp thụ trong vùng tử ngoại và ánh sáng nhìn thấy được áp dụng để xác định nồng độ. Vì theo định luật Lambert - Beer thì mật độ quang học (D) tỷ lệ thuận với nồng độ dung dịch (C). Vì vậy, muốn xác định nồng độ của một chất cần nghiên cứu thì trước tiên phải có đồ thị chuẩn D = f(λ) của chất nghiên cứu chuẩn (tự làm hay lấy từ tài liệu tham khảo (xem hình 8.2). Sau đó lấy dung dịch chất cần nghiên cứu đo được giá trị mật độ quang học là Dx, dựa vào đồ thị chuẩn sẽ suy ra được nồng độ Cx. Để xác định nồng độ vi khuẩn (Cvk) cách làm cũng tương tự, chỉ việc thay nồng độ phân tử gam (M) bằng số lượng vi khuẩn trong 1ml và đo ở bước sóng λ=650nm (xem hình 8.9). Ví dụ: Từ đồ thị chuẩn D = f(λ=260nm) của dung dịch ADN chuẩn đã biết được nếu D260 (mật độ quang học đo ở λ=260nm) bằng 1 sẽ tương ứng với nồng độ ADN là 50 microgam/ml, nếu D260 bằng 0,5 tương ứng với nồng độ ADN là 25 microgam/ml, nếu D260 bằng 0,1 tương ứng với nồng độ ADN là 5 microgam/ml. D(650nm) Dx O Cx C D=f(λ) Hình 8.9: Nồng độ vi khuẩn (Cvk) xác định bằng cách đo mật độ quang học (D) Phương pháp đo quang phổ hấp thụ còn có thể cho phép xác định thành phần của phân tử. Từ bảng 8.1 đã biết hệ số hấp thụ kmax của 4 bazơ Nitơ là Adenin, Timin, Guanin, Xitozin. Dựa vào bước sóng λmax trong bảng 8.1 sẽ đo được mật độ quang học tương ứng của mỗi bazơ Nitơ. Áp dụng công thức (8.10) D = k.C.l và khi chọn cuvét có độ dày l = 1Cm thì suy ra D = k.C. Khi biết D và k sẽ tính được nồng độ k DC = . * Phương pháp phân tích hấp thụ nguyên tử - Phân tích định tính: Sự hấp thụ của nguyên tử vật chất đối v