Công cụ và kỹ thuật khám phá thế giới Protein

Công cụ và kỹ thuật khám phá thế giới Protein Thành Phố Hồ Chí Minh 5/2004 Giới thiệu về Proteomics Thuật ngữ Proteome: các phần protein chuyên biệt về thời gian và về mặt tế bào được biểu hiện từ Genome. Bộ gen: khá ổn định, đồng nhất trong tế bào của một sinh vật và không có nhiều thay đổi trong loài. Protein lại biến động theo thời gian và dễ dàng phản ứng với các yếu tố bên ngoài, và đặc biệt là khác nhau rất nhiều về căn bản giữa các loại tế bào khác nhau. Proteomics là quá trình nghiên cứu toàn bộ protein hay các phần protein bổ sung hình thành từ một mô hay một dòng tế bào. Ngày nay, proteomics có thể được chia thành proteomics kinh điển (Classical) và Proteomics chức năng. Classical proteomics tập trung nghiên cứu vào toàn bộ hệ protein từ hai dòng tế bào được xử lý khác nhau, trong khi đó Proteomics chức năng nghiên cứu vào một nhóm protein giới hạn hơn. Có ba vấn đề chính được đặt ra cho Proteomics: 1) Các loại protein nào hiện diện? 2) Một protein đặc trưng có tương tác gì với các protein khác? 3) Protein đặc trưng đó như thế nào (về mặt cấu trúc)? Giới thiệu về Proteomics Thuật ngữ Proteomics bao hàm một sự nghiên cứu rộng nhằm mục đích tìm hiểu và giám sát hoạt động chức năng của các protein. Proteomics bao gồm các công việc tương tự tìm trình tự di truyền bằng cấu trúc không gian ba chiều của protein và trong chức năng protein, phát triêûn các kỹ thuật tách chiết protein và lập hồ sơ protein, nghiên cứu các tương tác giữa protein với protein. Proteomics hứa hẹn khám phá ra những mục tiêu mới cho nghiên cứu dược phẩm thông qua việc nghiên cứu chức năng của hàng ngàn protein chưa xác định mà người ta mong muốn sẽ được phát hiện trong nghiên cứu bộ gen người. Proteomics cung cấp dữ liệu nghiên cứu để cải thiện các chương ttrình phần mềm máy tính nhằm dự đoán cấu trúc protein từ các trình tự DNA; Nó cho phép chúng ta có thể giải thích thông tin có chứa trong toàn bộ gen. Giới thiệu về Proteomics Proteomes Nghiên cứu các protein được biểu hiện từ Gene Phân tích Protein một cách hệ thống và đồng bộ Bộ gen sẽ cung cấp những điều kỳ diệu??? Tế bào DNA (genes) mRNA proteins Nhưng, chỉ có 30,000 gene trong bộ gene người, mà có tới hơn 100,000 protein trong hệ Proteome người. Genomics đã cung cấp một lượng rất lớn dữ liệu, nhưng hầu hết chúng ta vẫn chưa giải thích được cho đến nay. Trong một số trường hợp, Genomics cho chúng ta nhiều câu hỏi hơn là câu trả lời. Các vấn đề nảy sinh của proteomics hứa hẹn trả lời cho một số câu hỏi đó bằng việc nghiên cứu có hệ thống tất cả các protein được mã hóa bởi bộ gene. Bộ gen sẽ cung cấp những điều kỳ diệu??? Điện di hai chiều - Two-dimensional electrophoresis (2-DE) là công cụ thí nghiệm truyền thống đáng tin cậy nhất trong phân tách hàng ngàn protein trên cùng một bản gel. Xác định Protein bằng khối phổ (mass spectrometry) là công cụ tốt nhất hiện nay trong phân tích protein và là một trong những kỹ thuật chủ yếu trong các lãnh vực nghiên cứu protein. Protein microarrays cung cấp một quá trình phân tích định lượng một lượng lớn các tương tác giữa các phân tử. Nhiều thí nghiệm sử dụng Microarray thường thực hiện chung với khối phổ. Các phương pháp khác: X-ray crystallography, NMR, Edman degradation, etc. CÁC PHƯƠNG PHÁP TRONG PROTEOMICS • Kết hợp giữa isoelectic focusing (IEF) và SDS-PAGE – cho kết quả có độ phân giải cao hơn rất nhiều so với từng phương pháp riêng biệt . • IEF- phân tách protein dựa trên điện tích hay đểm đẳng điện (isoelectric points); • SDS-PAGE – Phân tách protein theo kích thước (size). ĐIỆN DI HAI CHIỀU (2D-electrophoresis) IPG Sample Prep SDS-PAGE 2-D PAGE for Protein Separations Stain / blotCơ quan / mô / Tế bào 2-D Array Phân đoạn/ Hòa tan 2-D array Nhuộm hay chuyển lên màng lai Ưùng dụng điện di hai chiều trong nghiên cứu Proteomics 1) Phác thảo nên một phương pháp để khám phá proteomics. 2) Xác định các phương pháp để tối ưu hóa các kết quả điện di hai chiều. 3) Đưa ra các chọn lựa cho việc chuẩn bị mẫu để phân tích các hệ thống phức tạp. 4) Cho phép phân tích các biểu hiện phân biệt trong Proteomics. ĐIỆN DI HAI CHIỀU (2D-electrophoresis) Bước đầu tiên trong phân tích 2-DE analysis là quá trình chuẩn bị mẫu; proteins có trong tế bào hay mô cần nghiên cứu phải được hòa tan và tất cả DNA và các chất tạp nhiễm phải được loại ra khỏi dung dịch. Các phương pháp chuẩn bị mẫu tùy thuộc vào mục đích của nghiên cứu và đây chính là chìa khoá để các thí nghiệm được thực hiện thành công. Các yếu tố như độ hòa tan, kích thước, điện tích và điểm đẳng điện (pI) của protein phải được tính đến trong quá trình chuẩn bị mẫu. ĐIỆN DI HAI CHIỀU (2D-electrophoresis) Điện di chiều thứ hai: quá trình điện di SDS-PAGE thông thường, các strip IPG được dùng như là mẫu điện di. Việc chọn lựa gel sử dụng cho điện di chiều thứ hai tùy thuộc vào trọng lượng phân tử (MW) cần tách. Để có thể phân tích lượng lớn protein, có thể chạy nhiều gel cùng lúc. Các thang protein chuẩn được dùng để xác định trọng lượng phân tử của protein cần phân tích. ĐIỆN DI HAI CHIỀU Quá trình chuẩn bị mẫu hiệu quả sẽ: 1. Hòa tan tất cả protein có trong mẫu 2. Ngăn cản sự tích tụ và giảm tính tan trong khi điện di 3. Ngăn cản việc giảm hoạt tính về mặt hóa học hay enzyme của protein mẫu. 4. Loại bỏ hoặc tiêu hủy hoàn toàn các acid nucleic hay các phân tử gây ảnh hưởng khác. 5. Hiệu suất thu hồi các protein mong muốn ở mức phát hiện được. Chuẩn bị mẫu – chìa khóa thành công ĐIỆN DI HAI CHIỀU Hầu hết các protein đều cần thiết một số thí nghiệm để xác định các điều kiện tối ưu cho điện di 2 chiều. Sự khác nhau về nồng độ các chất sử dụng có thể ảnh hưởng đến kết quả phân tích. Urea và thiourea được dùng để giúp hoà tan protein, Urea thường được sử dụng ở nồng độ 8M. Các chất tẩy khác cũng được sử dụng để làm tăng tính hòa tan của protein ở điểm đẳng điện. Các chất mang lưỡng tính Ampholytes làm trung hòa và giúp các protein không kết tủa trong quá trình điện di. Chuẩn bị mẫu – chìa khóa thành công ĐIỆN DI HAI CHIỀU Các chất khử như DTT hay TBP được sử dụng để phá vỡ cầu nối disulfide. Nồng độ DTT quá cao sẽ ảnh hưởng đến gradient pH vì pKa của DTT xấp xỉ 8. Bio-Rad cung cấp một giải pháp tối ưu cho quá trình chuẩn bị mẫu Protein: ReadyPrep sequential extraction Kit Chuẩn bị mẫu – chìa khóa thành công MẪU Residue 1 Dung dịch 1 Tris, pH 9.5 Supernatant Residue 2 Dung dịch 2 Urea/CHAPS/Tris Bio-Lyte® / TBP Residue 3 Dung dịch 3 Urea/thiourea/CHAPS/SB3-10 Tris/Bio-Lyte® / TBP ReadyPrep Sequential Extraction Kit 40–80% 12–49% 5–8% 1%– 6% Supernatant Supernatant Sequential Extraction Extract 1 Extract 2 Extract 3 200 g of E. coli proteins - each gel Whole lysate 8% 16% 4 7 ĐIỆN DI HAI CHIỀU (2D-electrophoresis) + – pH 3 pH 7.5 pH 10 + – pH 3 pH 7.5 pH 10 + – pH 3 pH 7.5 pH 10 + – pH 3 pH 7.5 pH 10 2-D Electrophoresis The 1st Dimension: Isoelectric Focusing (IEF) First Dimension IEF • PROTEAN IEF Cell (Bio-Rad) – Thiết bị chính của các PTN 2-D • Thiết kế phù hợp dễ dàng sử dụng – Khay có 12 kênh để focusing – Các khay hydrat hóa được tách riêng để đạt được lượng mẫu lớn. – Có thể lập và lưu chương trình trong máy. • Các strip 7,11,17,18,& 24 cm • 10,000 volts and Peltier cooling • Bộ load mẫu có 12 kênh. 3 -10 4 - 7 3 - 6 5 - 8 7 - 10 ReadyStrip™ IPG Strips Năm kích thước: • - 7 cm, 11 cm, 17 cm, 18 cm and 24 cm Có thể sử dụng các strip overlap để xác định protein Các Ranges nhỏ giúp độ phân giải cao và hạn chế lượng protein quá lớn: 3.9 - 5.1, 4.7 - 5.9, 5.5 - 6.7, 6.3 - 8.3 Zoom In Broad Range pH 3-10 Narrow Range pH 4-7 Micro Range pH 4.7-5.9 3 104 4 7 74.7 5.9 4.7 5.9 Nhiều kết quả với khoảng pH hẹp của IEF pH 3 - 10 pH 7 - 10 pH 5 - 8 pH 3 - 6 pH 3-10 pH 3- 6 pH 5- 8 pH 7-10 + – pH 3 pH 7.0 pH10 Điện tích Kích thuớc The 2nd Dimension: SDS-PAGE Proteins di chuyển qua gel với tốc độ thích hợp với kích thước của chúng. Protein nhỏ nhất sẽ di chuyển xa nhất. Mini-PROTEAN 3, CRITERION Cell, PROTEAN II Large, Mid and Mini Pre - Cast Gels Tất cả các loại hoá chất, thuốc nhuộm, dung dịch đệm và protein chuẩn. 2nd Dimension: Pre-Cast Gel Technology CRITERION Cell Điện di trên gel lượng lớn Protein • PROTEAN Plus Dodeca Cell – Chạy cùng lúc 12 gels – Độ lặp lại cao (Excellent reproducibility) • Hệ thống làm lạnh • Các điện cực dạng đĩa. – Có thể dùng hai kích thước gel khác nhau với cùng một cell (18 và 20cm). – Dễ dàng thao tác • Gel chuẩn bị sẵn A Complete Large-format Family ĐIỆN DI HAI CHIỀU (2D-electrophoresis) Sau khi chạy điện di hai chiều, để quan sát protein ta có thể nhuộm protein bằng nhiều loại thuốc nhuộm khác nhau. Tùy thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau bao gồm: -Độ nhạy mong muốn -Độ tiện dụng -Giá thành -Các loại thiết bị nhuộm sẵn có Một số loại protein có thể được nhuộm sau khi đã chuyển lên màng dùng trong lai protein. Các thuốc nhuộm thông thường sử dụng là: Coomasie Blue, Sybro Ruby hay nhuộm bạc.  Khay nhuộm Tối ưu hóa hiệu quả nhuộm protein  Kệ lắc  Dung dịch nhuộm Mô tơ quay Thiết bị lắc lý tưởng để tối ưu hoá hiệu quả nhuộm protein Các thuận lợi khi dùng 2-DE Các nguyên liệu (các chất phân giải từ tế bào, mô) có thể được áp dụng trực tiếp lên bản gel. • Có thể phát hiện gần như toàn bộ protein có trong mẫu. • Xem xét được sự thay đổi giữa mẫu chuẩn và mẫu cần nghiên cứu. • Các protein được tách có thể chiết ra để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo trong việc tìm hiểu cấu trúc và chức năng protein. Differential Expression A B E. Coli grown at 30º C E. Coli grown at 42º C Ghi nhận và phân tích hình ảnh • Nhân tố quan trọng nhất của 2-D là việc ghi lại hình ảnh kỹ thuật số, một phương tiện thực tế để thu nhận các dữ liệu về protein. • Nó cho phép so sánh một cách khách quan thông tin về proteome, chuyển giao thông tin giữa nhiều nghiên cứu khác nhau, và cho phép lập danh mục số lượng lớn dữ liệu về protein. • Các hình ảnh được xử lý và so sánh trên các phần mềm vi tính. Các hệ thống thu nhận hình ảnh Molecular Imager ® FX Pro Plus ™ Multiimager System Fluorescence and Storage Phosphor Imaging GS-800 ™ Calibrated Densitometer Reflectance and Transmittance Modes 30 x 40 cm scanning area VersaDoc Imaging System CCD–Based UV / Visible, Fluorescence & Chemiluminescence PDQuest 7.1: Nét mới ý nghĩa • Tăng cường hình ảnh cho gel nhuộm bởi SYPRO Ruby • Hệ dữ liệu phân biệt mới. • Cải thiện tính năng cho các công cụ quan sát protein. – Quan sát được không gian ba chiều • Tăng cường độ nhạy cho các công cụ phân tích thống kê – Cải thiện các công cụ phân tích so sánh định lượng, người sử dụng có thể chọn lựa các mức độ phân tích khác nhau. – Có thể phân tích cùng lúc nhiều hơn hai mẫu. Mass spec identification Xác định Protein Imaging systems Image analysis 2-D array gel / blot Protein excision OOOOO OOOOO OOOOO OOOOO OOOOO • Tự động phát hiện và cắt các điểm protein đã được tách trên bản gel. • Phân phối vào các giếng hay các đĩa thu mẫu. • Hoạt động độc lập hay điều khiển bởi phần mềm. Proteomics: Spot Cutter Analysis image Spot Cutter image Proteomics: Spot Cutter Xác định Protein • Các protein đã được phân lập từ gel được phân nhỏ để giải phóng ra các phân tử peptide. xác định trình tự. • Xác định và phân loại protein. Micromass MassPREP Digestion Station • Rửa sạch mẫu • ZipTip microSPE • Automated M@LDI target loading Micromass M@LDI HT Micromass networked MALDI TOF-MS & sample management system “2D-gel-MS analyser for proteomics factories” 1. Peptide-mass fingerprinting (100’s of samples/day) - MALDI-TOF MS 2. Sequence tagging (10 samples/hour) - Proteins Not ID’d by “Fingerprinting” - ES MS/MS (Q-Tof) 3. De novo sequencing (10 samples/day) - ES MS/MS (Q-Tof) Mass Spectrometry MS in proteomics: protein sequencing Công cụ và kỹ thuật khám phá thế giới Protein Thành Phố Hồ Chí Minh 5/2004 Chân thành cảm ơn!