Đánh giá khả năng làm thay đổi số lượng vi khuẩn sinh hợp chất sulfur bay hơi trên bề mặt lưng lưỡi của sữa chua chứa probiotic

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014  Nghiên cứu Y học Răng Hàm Mặt  347 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG LÀM THAY ĐỔI SỐ LƯỢNG VI KHUẨN   SINH HỢP CHẤT SULFUR BAY HƠI TRÊN BỀ MẶT LƯNG LƯỠI   CỦA SỮA CHUA CHỨA PROBIOTIC  Võ Mạnh Hùng*, Đặng Vũ Ngọc Mai*, Huỳnh Công Nhật Nam*  TÓM TẮT  Mở đầu: Probiotic đã được sử dụng trong nhiều lĩnh vực y khoa, bao gồm cả việc điều trị các bệnh nhiễm  khuẩn. Chúng được cho là có khả năng làm giảm một số nguy cơ gây ra bệnh răng miệng. Một số loài vi khuẩn  trong miệng có khả năng sinh ra các hợp chất sulfur bay hơi trong quá trình chuyển hóa, là nguyên nhân gây ra  mùi khó chịu ở miệng  Mục tiêu: Nghiên cứu được thực hiện nhằm đánh giá khả năng làm thay đổi số lượng vi khuẩn sinh hợp  chất sulfur bay hơi trên bề mặt lưng lưỡi sau khi ăn sữa chua chứa probiotic trong 2 tuần, so sánh với sữa chua  không có bổ sung probiotic.  Đối tượng ‐ Phương pháp: Nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng, ngẫu nhiên, mù đôi, bắt chéo. 15 đối tượng  nghiên cứu được chia ngẫu nhiên làm 2 nhóm: nhóm I và nhóm II; và trải qua một quy trình nghiên cứu gồm 4  giai đoạn. Giai đoạn 1 và 3, hai nhóm trải qua thời kỳ rửa trong vòng 1 tuần. Ở giai đoạn 2, nhóm I ăn sữa chua  thường (không chứa probiotic), nhóm II ăn sữa chua chứa probiotic trong 2 tuần. Đến giai đoạn 4, hai nhóm đổi  loại sữa chua. Trước và sau giai đoạn 2 và 4, lấy mẫu mảng bám trên bề mặt lưng lưỡi các đối tượng nghiên  cứu, sau đó pha loãng, nuôi cấy trong môi trường thạch chọn lọc. Số lượng vi khuẩn sinh hợp chất sulfur bay hơi  trên bề mặt lưng lưỡi được đếm qua số lượng khúm vi khuẩn màu nâu hoặc đen trên bề mặt thạch.  Kết quả: Số lượng vi khuẩn sinh hợp chất sulfur bay hơi trên bề mặt lưng lưỡi giảm có ý nghĩa thống kê ở  nhóm ăn sữa chua chứa probiotic trong 2 tuần (p = 0,003). Trong khi đó, ở nhóm ăn sữa chua thường, số lượng  vi khuẩn sinh hợp chất sulfur bay hơi tăng không có ý nghĩa thống kê (p = 0,776).  Kết luận: Số lượng vi khuẩn sinh hợp chất sulfur bay hơi trên bề mặt lưng lưỡi giảm có ý nghĩa sau khi ăn  sữa chua chứa probiotic trong 2 tuần.  Từ khóa: probiotic, VSCs, sữa chua.  ABSTRACT  THE EFFECT OF PROBIOTIC‐CONTAINING YOGURT ON THE NUMBER OF VOLATILE SULFUR  COMPOUNDS‐PRODUCING BACTERIA ON THE DORSAL SURFACE OF TONGUE  Vo Manh Hung, Dang Vu Ngoc Mai, Huynh Cong Nhat Nam   * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 ‐ Supplement of No 1 ‐ 2014: 347 ‐ 351  Background: The probiotic bacteria are used in many medical indications, including the treatment of disease  caused by bacteria. They are thought to reduce the risk of some oral diseases. Some bacteria produce volatile sulfur  compounds during their metabolism, which cause oral malodor.  Objectives: The aim of the study was to assess the effect of probiotic‐containing yogurt on the number of  volatile sulfur compounds‐producing bacteria on the dorsal surface of tongue after 2 weeks of daily eating.  Method: A double‐blind, randomized, cross‐over study was performed. 15 healthy subjects were randomized  into two groups: I and II. They followed over four periods. Periods 1 and 3 were 1‐week wash‐out periods. During  * Khoa Răng Hàm Mặt, Đại Học Y Dược TP HCM   Tác giả liên lạc: BS. Võ Mạnh Hùng ĐT: 0986969471  Email: vomanhhung.rhm@gmail.com Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Chuyên Đề Mắt – Tai Mũi Họng – Răng Hàm Mặt 348 period 2,  the subjects  in group  I were given normal yogurt  (non‐probiotic) and  the subjects  in group  II were  given  probiotic‐containing  probiotic  for  2  weeks  (200g  daily).  Being  cross‐over  study,  the  yogurts  were  interchanged in the two group in period 4. At the beginning and the ending of the periods 2 and 4, the plaque  sample on the dorsal surface of tongue was taken, diluted and cultured on selective bacteria growth media. The  number of volatile  sulfur  compounds‐producing bacteria on  the dorsal  surface of  tongue were  counted by  the  number of black or brown colonies on the media.  Results:  A  statistically  significant  decrease  (p  =  0.003)  of  the  number  of  volatile  sulfur  compounds‐ producing bacteria on the dorsal surface of tongue was recorded in the group using probiotic‐containing yogurt.  While  in  the group using normal yogurt, a statistically non‐significant  increase  (p = 0.776) of  the number of  volatile sulfur compounds‐producing bacteria was recorded.  Conclusion: The number of volatile sulfur compounds‐producing bacteria on the dorsal surface of tongue  decreased statistically after 2 weeks of daily eating probiotic‐containing yogurt.  Keywords: probiotic, VSCs, yogurt.  ĐẶT VẤN ĐỀ  Một  trong những vấn  đề  răng miệng  được  quan tâm hiện nay chính là hôi miệng. Nguyên  nhân chính gây hôi miệng là do vi khuẩn có khả  năng sinh ra các hợp chất sulfur bay hơi có mùi  trong miệng, chủ yếu là những vi khuẩn trên bề  mặt lưng lưỡi.  Ngày  nay,  probiotic  cũng  như  liệu  pháp  probiotic  được  các nhà khoa học nhắc  tới như  một cách  thức mới góp phần kiểm soát một số  bệnh  răng miệng.  Probiotic,  hay  còn  gọi  là  lợi  khuẩn, được định nghĩa là những tổ chức vi sinh  vật  sống,  có  khả  năng  đem  lại  lợi  ích  cho  sức  khỏe  con người khi  được  cung  cấp một  lượng  nhất định(3).  Một  trong những  sản phẩm  chứa probiotic  thông dụng chính là sữa chua. Sữa chua đã được  chứng minh có ảnh hưởng tốt đến sức khỏe con  người  thông qua cơ chế giữ hệ vi  sinh vật  cân  bằng trong ruột hay cơ chế cạnh tranh giữa các  vi  khuẩn  trong  sữa  chua  với  các  vi  khuẩn  có  hại(2). Sữa chua chứa lợi khuẩn cũng có hiệu quả  nhất định lên hệ vi khuẩn trong miệng, giúp cải  thiện  tình  trạng  bệnh  lý  vùng miệng  như  nha  chu, sâu răng, hôi miệng... Caglar (2005) đã thực  hiện một  nghiên  cứu  ngẫu  nhiên, mù  đôi,  bắt  chéo trên 26 đối tượng, sử dụng sữa chua chứa  Bifidobacterium  animalis  trong  2  tuần,  cho  thấy  sữa  chua  có  khả  năng  làm  giảm  số  lượng  Streptococcus mutans  và  lactobacilli  trong  nước  bọt(1).  Đến  nay,  chưa  có một  nghiên  cứu  về  khả  năng  của  sữa  chua  chứa probiotic  sản  xuất  tại  Việt Nam làm thay đổi các chỉ số liên quan đến  tình  trạng  hôi miệng.  Nghiên  cứu  được  thực  hiện nhằm đánh giá khả năng  làm  thay đổi  số  lượng vi khuẩn sinh hợp chất sulfur bay hơi trên  bề  mặt  lưng  lưỡi  sau  khi  ăn  sữa  chua  chứa  probiotic  trong  2  tuần,  so  sánh  với  sữa  chua  không có bổ sung probiotic với 2 mục tiêu cụ thể  sau:  ‐ So  sánh  số  lượng vi khuẩn  sinh hợp  chất  sulfur bay hơi trên bề mặt lưng lưỡi trước và sau  khi  ăn  sữa chua chứa và không chứa probiotic  trong 2 tuần.  ‐ So sánh sự thay đổi số lượng vi khuẩn sinh  hợp  chất  sulfur  bay hơi  trên  bề mặt  lưng  lưỡi  giữa hai nhóm ăn hai loại sữa chua.  ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU  Đối tượng nghiên cứu  Tiêu chuẩn chọn mẫu: Khỏe mạnh, không có  bệnh toàn thân; không có bệnh vùng miệng (sâu  răng, viêm nướu từ  trung bình đến nặng, viêm  nha chu, các bệnh viêm nhiễm vùng miệng, khô  miệng...); không sử dụng kháng sinh trong vòng  1  tháng  trước khi  tham gia nghiên  cứu; không  mang phục hình, khí cụ chỉnh hình; không hút  thuốc; không dị ứng với sữa và các sản phẩm từ  sữa.  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014  Nghiên cứu Y học Răng Hàm Mặt  349 Trong suốt  thời gian  thực hiện nghiên cứu,  loại  trừ  các  đối  tượng  sử dụng kháng  sinh,  đồ  uống có cồn; có điều trị các bệnh toàn thân hay  bệnh răng miệng.  Mẫu nghiên cứu cuối cùng gồm 15 sinh viên  khoa Răng Hàm Mặt, độ tuổi từ 18‐24.  Phương pháp nghiên cứu  Thiết kế nghiên cứu: nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng,  ngẫu nhiên, mù đôi, bắt chéo.  Quy trình nghiên cứu:  Nghiên cứu gồm 2 lần thử nghiệm với 1 thời  kỳ rửa trước  lần thử nghiệm đầu tiên và 1 thời  kỳ  rửa  xen  kẽ  .  15  đối  tượng  được  chia  ngẫu  nhiên làm 2 nhóm: nhóm I gồm 8 người, nhóm  II gồm 7 người.  Giai đoạn 1: là thời kỳ rửa trước lần thử nghiệm đầu  tiên  7 ngày trước khi lấy mẫu lần 1, các đối tượng  được cung cấp một tờ cẩm nang hướng dẫn, bàn  chải không có mặt chải  lưỡi và kem đánh răng  không  có  chất  kháng  khuẩn,  không  sử  dụng  thêm  các  biện  pháp  vệ  sinh  răng miệng  khác  như nước súc miệng, chải lưỡi.  Lần lấy mẫu 1: Kể từ lần chải răng cuối cùng  tối hôm  trước  đến  buổi  sáng  lấy mẫu,  các  đối  tượng  không  vệ  sinh  răng  miệng,  không  ăn,  không uống bất kì  loại nước nào  trừ nước  lọc.  Các đối tượng được lấy mẫu mảng bám trên bề  mặt lưng lưỡi. Dùng bàn chải răng vô khuẩn đặt  trên  lưng  lưỡi,  sao  cho  đầu bàn  chải  ở  đỉnh V  lưỡi, ấn bàn chải nhưng không kéo bàn chải di  chuyển. Hòa  lượng mảng  bám  dính  trên  bàn  chải vào 20ml dung dịch nước cất vô trùng đựng  trong ống nghiệm. Chuyển các mẫu vào phòng  xét nghiệm vi sinh.  Giai đoạn 2: là lần thử nghiệm đầu tiên  Các đối tượng được nhận sữa chua và ăn mỗi ngày 2  lần, mỗi lần 1 hộp, khối lượng 100g, sau bữa trưa và  bữa  tối  trong  14 ngày  tiếp  theo. Các  hộp  sữa  chua  được che nhãn hiệu bằng decal để đối tượng nghiên  cứu không biết đang ăn loại sữa chua nào. Nhóm I ăn  sữa  chua  thông  thường, nhóm  II  ăn  sữa  chua  chứa  probiotic.   Lần lấy mẫu 2: thực hiện vào buổi sáng sau  khi kết thúc 14 ngày ăn sữa chua. Cách thực hiện  tương tự lần lấy mẫu 1.  Giai đoạn 3: là thời kỳ rửa xen kẽ  Tất cả các đối tượng nghiên cứu  lặp  lại quá  trình rửa tương tự giai đoạn 1.  Lần lấy mẫu 3: thực hiện vào buổi sáng sau  khi kết thúc 7 ngày của giai đoạn 3.  Giai đoạn 4: là lần thử nghiệm lần thứ 2  Thực hiện  tương  tự giai đoạn 2,  trong đó 2  nhóm nghiên cứu đổi loại sữa chua đã ăn trong  giai đoạn 2.  Lần lấy mẫu 4: thực hiện vào buổi sáng sau  khi kết thúc 14 ngày của giai đoạn 4.  Qui trình trong phòng xét nghiệm vi sinh  Pha  loãng mẫu với  tỉ  lệ 1/5. Lấy 50μl dung  dịch  đã  pha  loãng  cấy  dàn  trải  lên  đĩa  thạch  chứa môi  trường  nuôi  cấy  chọn  lọc  vi  khuẩn  sinh hợp chất sulfur bay hơi. Ủ trong môi trường  yếm khí  ở 370C  trong 7 ngày. Sau  thời gian  ủ,  đếm  số khúm vi khuẩn  có màu nâu hoặc  đen  mọc  trên mặt  đĩa  thạch. Tính  ra  số  đơn vị  tạo  khúm trên mỗi đơn vị thể tích.  KẾT QUẢ    Số  lượng  vi  khuẩn  sinh  hợp  chất  sulfur  bay hơi  trước và  sau khi  ăn mỗi  loại  sữa  chua  Bảng 1: Số đơn vị tạo khúm (x105 CFU/ml) trung bình của hai nhóm trước và sau khi ăn hai loại sữa chua.  Loại sữa chua n Trước (x 105 CFU/ml) Sau (x 105 CFU/ml) p Sữa chua thường  15  52,73 ± 41,46  64,20 ± 111,92  00,776*  Sữa chua probiotic  15  64,07 ± 40,07  19,07 ± 12,65  0,003*  (*) Test Wilcoxon.  Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Chuyên Đề Mắt – Tai Mũi Họng – Răng Hàm Mặt 350 Đối với nhóm ăn sữa chua thường, số lượng  vi khuẩn sinh hợp chất sulfur bay hơi  tăng, sự  thay đổi này không có ý nghĩa thống kê. Đối với  sữa chua probiotic, số lượng vi khuẩn sinh hợp  chất sulfur bay hơi giảm, sự thay đổi này rất có ý  nghĩa thống kê (p < 0,01).  Sự thay đổi số lượng vi khuẩn sinh hợp chất sulfur bay hơi sau khi ăn 2 loại sữa chua  Bảng 2: Số đơn vị tạo khúm (x105 CFU/ml) thay đổi trung bình của hai nhóm sau khi ăn hai loại sữa chua.  n Trước (x 105 CFU/ml) Sau (x 105 CFU/ml) Thay đổi (x 105 CFU/ml) Sữa chua thường 15 52,73 ± 41,46 64,20 ± 111,92 tăng 11,47 ± 109,07 Sữa chua probiotic 15 64,07 ± 40,07 19,07 ± 12,65 giảm 45,00 ± 47,46 p = 0,033** (**) Phép kiểm định phi tham số Mann ‐ Whitney U.  Nhóm ăn sữa chua  thường  tăng  trung bình  11,47 x 105  (CFU/ml),  trong khi nhóm sữa chua  probiotic làm giảm trung bình 45 x 105 (CFU/ml)  trong 2  tuần. So sánh số đơn vị  tạo khúm  thay  đổi trung bình của hai nhóm, nhận thấy sự khác  biệt này có ý nghĩa thống kê (p < 0,05).  Bảng 3: Tỉ lệ (%) thay đổi số lượng vi khuẩn sinh  hợp chất sulfur bay hơi trung bình của hai nhóm sau  khi ăn hai loại sữa chua.  Loại sữa chua n Tỉ lệ thay đổi (%) Sữa chua thường 15 tăng 51,82 ± 181,05 (%) Sữa chua probiotic 15 giảm 42,11 ± 83,73 (%) Chọn một vài khúm vi khuẩn đặc  trưng có  màu nâu hoặc  đen,  đứng  riêng  lẻ  trên  bề mặt  thạch,  thực  hiện  phép  nhuộm  gram.Quan  sát  dưới  kính  hiển  vi  thấy  hầu  hết  là  trực  khuẩn,  phẩy khuẩn... gram âm.  BÀN LUẬN  Phương pháp thiêt kế bắt chéo cùng với các  thời kỳ rửa trong nghiên cứu này giúp kiểm soát  được những yếu  tố gây nhiễu  từ chính các đối  tượng  nghiên  cứu  ảnh  hưởng  lên  kết  quả.  Số  lượng  vi  khuẩn  sinh  hợp  chất  sulfur  bay  hơi  trước khi ăn mỗi loại sữa chua không có sự khác  biệt giữa 2 nhóm (bảng 4).  Bảng 4: Số đơn vị tạo khúm vi khuẩn (CFU/ml) sinh  VSCs trung bình của hai nhóm trước khi ăn hai loại  sữa chua  Loại sữa chua n Trước x105 (CFU/ml) Sữa chua thường 15 46,80 ± 37,47 Sữa chua probiotic 15 62,05 ± 35,63 p = 0,325*** (***) phép kiểm định phi tham số Mann ‐ Whitney U.    Môi  trường  thạch  nuôi  cấy  sử  dụng  trong  nghiên  cứu  là  thạch  Columbia  base  bổ  sung  glutathione và  chì acetate. Glutathione  được vi  khuẩn sử dụng  trong quá  trình chuyển hóa và  tạo  ra hydro  sulfide. Chì acetate phản  ứng với  hydro  sulfide  tạo  nên  kết  tủa  chì  sulfide màu  đen. Vì vậy  các vi khuẩn  sinh hợp  chất  sulfur  bay hơi mọc thành khúm màu nâu hoặc đen trên  môi trường nuôi cấy(5).  Hojo  (2005)  đã  thực  hiện  nghiên  cứu  thử  nghiệm  lâm  sàng  trên  24  đối  tượng bằng  cách  cho  ăn  180g  sữa  chua mỗi  ngày  và  nhận  thấy  sau 6  tuần chỉ số hydro sulfide giảm(4). Nghiên  cứu  của  chúng  tôi  khảo  sát  trên  vi  khuẩn  là  nguồn  sinh hợp  chất bay hơi này và  cũng  cho  thấy số lượng vi khuẩn giảm.  Nghiên  cứu  này  vẫn  còn  điểm  hạn  chế  vì  thực hiện với cỡ mẫu nhỏ,  đối  tượng chọn  lựa  không phải  là những người  có hôi miệng  thật  sự. Các  kết  quả  có  được mới  chỉ  là  bước  đầu  trong nghiên cứu về  tác dụng của probiotic  lên  các chỉ số liên quan tình trạng hôi miệng. Cần có  những nghiên cứu với cỡ mẫu  lơn hơn, với đối  tượng có  tình  trạng hôi miệng  thật sự và khảo  sát trên nhiều chỉ số khác nhau.  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014  Nghiên cứu Y học Răng Hàm Mặt  351 KẾT LUẬN  So sánh số lượng vi khuẩn sinh VSCs trên  bề mặt  lưng  lưỡi  trước và  sau khi  ăn  sữa  chua chứa probiotic, sữa chua không chứa  probiotic trong 2 tuần   Đối với sữa chua  thông  thường: số  lượng  vi khuẩn VSCs trên bề mặt lưng lưỡi trước khi  ăn là 52,73 ± 41,46 x 105 (CFU/ml), sau khi ăn là  64,20  ±  111,92  x  105  (CFU/ml).  Số  lượng  vi  khuẩn  tăng  51,82%  nhưng  không  có  ý  nghĩa  thống kê (p > 0,05).  Đối với sữa chua probiotic:  lượng vi khuẩn  sinh VSCs trên bề mặt lưng lưỡi trước khi ăn là  64,07 ± 40,07 x 105 (CFU/ml), sau khi ăn là 19,07 ±  12,65  x  105  (CFU/ml).  Số  lượng  vi  khuẩn  giảm  42,11% và có ý nghĩa thống kê (p < 0,01).    So  sánh  sự  thay  đổi  số  lượng  vi  khuẩn  sinh VSCs  trên bề mặt  lưng  lưỡi giữa hai  nhóm  sau khi  ăn  2  loại  sữa  chua  trong  2  tuần  Nhóm  ăn  sữa  chua  chứa  probiotic  sau  2  tuần  có  số  lượng vi khuẩn  sinh VSCs  trên bề  mặt lưng lưỡi giảm rõ rệt so với nhóm ăn sữa  chua thường.  TÀI LIỆU THAM KHẢO  1. Caglar  E,  Sandalli N, Twetman  S, Kavaloglu  S, Ergeneli  S,  Selvi S (2005). Effect of yogurt with Bifidobacterium DN‐173  010 on salivary mutans streptococci and lactobacilli in young  adults. Acta Odontol Scand; 63: 317‐320.  2. Elli  M,  Callegari ML,  Ferrari  S  (2006).  Survival  of  yogurt  bacteria in the human gut. Appl Environ Microbiol; 72: 5113‐ 5117  3. FAO (2001) Health and nutritional properties of probiotics in  food  including  powder milk with  live  lactic  acid  bacteria.  Food and Agriculture Organization of the United Nations.  4. Hojo  K,  Yashima  A,  Gomi  K, Maeda N  (2005).  Effects  of  Yoghurt on  the Human Oral Microbiota and Halitosis. The  83rd  General  Session,  International  Association  for  Dental  Research, Baltimore, MD.  5. Turng BF, Minah GE, Falker WA (1997). Development of an  agar medium for detection of oral H2S producing organisms. J  Dent Res 1997; 76:226 (IADR Abstracts).  Ngày nhận bài báo: 22/11/2013  Ngày phản biện nhận xét bài báo:15/12/2013  Ngày bài báo được đăng: 05/01/2014