Định lượng taninoid trong dược liệu

ĐỊNH LƯỢNG TANINOID TRONG DƯỢC LIỆU Có thể sử dụng 1 trong 2 phương pháp sau: PHƯƠNG PHÁP 1 Cân chính xác một khối lượng bột dược liệu đã rây qua rây số 355 (kích thước mắt rây 0,355 mm) và chứa khoảng 1 g taninoid, cho vào một bình nón, thêm 150 ml nước và đun trên cách thủy trong 30 phút. Để nguội, chuyển hỗn hợp vào bình định mức 250 ml. Thêm nước vừa đủ tới ngấn, lọc. Dịch lọc này dùng làm dung dịch thử. Xác định chất chiết được trong nước toàn phần Lấy chính xác 25 ml dung dịch thử đem bốc hơi đến khô, sấy cắn ở 105 0 C trong 3 giờ. Cân, được khối lượng T1 (g). Xác định chất chiết được trong nước không liên kết với bột da Lấy chính xác 100 ml dung dịch thử, thêm 6 g bột da khô (TT). Lắc đều trong 15 phút và lọc. Lấy chính xác 25 ml dịch lọc đem bốc hơi đến khô, sấy cắn ở 105 0C trong 3 giờ. Cân, được khối lượng T2 (g). Xác định bột da tan trong nước Lấy chính xác 100 ml nước cất, thêm 6 g bột da khô (TT). Lắc đều trong 15 phút và lọc. Lấy chính xác 25 ml dịch lọc bốc hơi đến khô, sấy cắn ở 105 0C trong 3 giờ. Cân, được khối lượng TO (g). Hàm lượng phần trăm (%) taninoid trong dược liệu tính theo công thức: 100 a 10)TT( o21  T a: Khối lượng dược liệu khô kiệt (g). PHƯƠNG PHÁP 2 Tiến hành trong điều kiện tránh ánh sáng. Chuẩn bị thuốc thử Thuốc thử Folin-Ciocalteu (1N): Pha loãng dung dịch thuốc thử Folin-Ciocalteu 2N (TT) với nước cất trong bình định mức. Bảo quản thuốc thử ở 4 ºC. Thao tác trong điều kiện tránh ánh sáng. Thuốc thử có màu vàng sáng. Không sử dụng khi thuốc thử chuyển xang màu xanh rêu. Dung dịch acid tannic chuẩn 0,1 mg/ml: Hòa tan 25 mg acid tannic (TT) (Merck) trong 25 ml nước rồi pha loãng tiếp với nước thành dung dịch 1:10. Thực hiện trong điều kiện tránh ánh sáng. Dung dịch chỉ pha khi dùng. Polyvinyl polypyrrolidon không tan: Dạng bột, tiêu chuẩn thuốc thử (Sigma, P 6755). Dung dịch thử Cân chính xác một lượng bột dược liệu (theo quy định của từng chuyên luận) cho vào một bình định mức 250 ml. Thêm 200 ml nước, lắc đếu, đậy kín và để yên 12 giờ nơi tối. Sau đó lắc đều và để trong bể siêu âm trong 10 phút, để nguội và bổ sung nước tới vạch. Lắc đều và để yên cho bã dược liệu lắng xuống. Lọc, bỏ 50 ml dịch lọc đầu. Lấy chính xác 20 ml dịch lọc sau cho vào bình định mức 100 ml. Bổ sung nước tới vạch. Xây dựng đường chuẩn Đường chuẩn định lượng được thực hiện theo bảng sau: Ống nghiệm Dung dịch acid tannic (0,1 mg/ml) Nước cất Thuốc thử Folin- Ciocalteu Dung dịch natri carbonat 20% (TT) (ml) (ml) (ml) (ml) Chứng 0,00 2,50 1,25 6,25 1 0,10 2,40 1,25 6,25 2 0,20 2,30 1,25 6,25 3 0,30 2,20 1,25 6,25 4 0,40 2,10 1,25 6,25 5 0,50 2,00 1,25 6,25 Đo độ hấp thu của các dung dịch so với ống chứng ở bước sóng 725 nm. Vẽ đường biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ và độ hấp thu (đường chuẩn). Đường chuẩn được xác định theo từng lần định lượng. Định lượng polyphenol toàn phần Lấy chính xác 0,5 ml dung dịch thử cho vào bình định mức 10 ml. Thêm 2 ml nước cất, 1,25 ml thuốc thử Folin-Ciocalteu và 6,25 ml dung dịch natri carbonat 20 % (TT). Thêm nước đến vạch, lắc đều và để yên 40 phút. Đo độ hấp thu của dung dịch so với ống chứng ở bước sóng 725 nm. Tính lượng polyphenol toàn phần trong dung dịch thử theo acid tannic dựa vào đường chuẩn. Lượng dung dịch thử có thể thay đổi sao cho độ hấp thụ của dung dịch nằm trong khoảng 0,15 – 0,5. Định lượng polyphenol đã loại tannin Lấy 500 mg polyvinyl polypyrolidon vào bình định mức 10 ml. Thêm vào 4 ml nước cất và chính xác 5 ml dung dịch thử. Bổ sung nước tới vạch và lắc đều. Giữ bình ở 4 ºC trong 15 phút. Lắc đều và đem ly tâm 3000 vòng/phút trong 10 phút. Lấy dịch ly tâm. Lấy chính xác 1,0 ml dung dịch thử cho vào bình định mức 10 ml. Thêm 1 ml nước cất, 1,25 ml thuốc thử Folin-Ciocalteu và 6,25 ml natri carbonat 20 % (TT). Thêm nước đến vạch, lắc đều và để yên 40 phút. Đo độ hấp thu của dung dịch so với ống chứng ở bước sóng 725 nm. Tính toán lượng polyphenol đã loại tannin trong dung dịch thử theo acid tannic dựa vào đường chuẩn. Lượng dung dịch thử tác dụng với polyvinyl polypyrolidon có thể giảm nếu lượng polyphenol toàn phần trong dung dịch vượt quá 10 mg. Lượng dịch ly tâm đem định lượng có thể thay đổi sao cho độ hấp thu của dung dịch nằm trong khoảng 0,15 – 0,5. Tính kết quả Lượng tannin tính theo acid tannic có trong dung dịch thử được tính từ lượng polyphenol toàn phần và polyphenol đã loại tannin. Từ kết quả trên tính ra phần trăm tannin có trong dược liệu khô kiệt.