Đột biến gen flt3 trong bệnh bạch cầu cấp dòng tủy không có bất thường nhiễm sắc thể

Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Chuyên Đề Nội Khoa 232 ĐỘT BIẾN GEN FLT3 TRONG BỆNH BẠCH CẦU CẤP DÒNG TỦY   KHÔNG CÓ BẤT THƯỜNG NHIỄM SẮC THỂ  Phan Thị Xinh*,**, Hoàng Anh Vũ*  TÓM TẮT  Đặt vấn đề: Xây dựng quy trình giải trình tự DNA để khảo sát tình trạng đột biến gen FLT3 trong bệnh  bạch cầu cấp dòng tủy (BCCDT).  Đối tượng và phương pháp: Mẫu tủy xương của 18 bệnh nhân BCCDT không kèm bất thường nhiễm sắc  thể được khảo sát đột biến gen FLT3 từ exon 14 đến exon 20 tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học TP.HCM từ  05/2012 đến 05/2013.  Kết quả: Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã khuếch đại vùng gen chứa các exon 14 đến exon 20 bằng một  cặp mồi duy nhất, cho phép phát hiện hầu hết các kiểu đột biến của gen FLT3. Khảo sát trên 18 bệnh nhân, chúng  tôi phát hiện 9 trường hợp (50%) có đột biến, bao gồm 6 trường hợp chèn đoạn của exon 14 và 3 trường hợp đột  biến điểm của exon 16 và 20.  Kết luận: Quy trình khảo sát đột biến gen FLT3 đã được xây dựng thành công tại Bệnh viện Truyền máu  Huyết học TP.HCM, giúp việc phân nhóm tiên lượng tốt hơn cho bệnh nhân BCCDT.  Từ khóa: Gen FLT3, đột biến, bạch cầu cấp dòng tủy, nhiễm sắc thể đồ.  ABSTRACT  FLT3 GENE MUTATIONS IN ACUTE MYELOID LEUKEMIA WITH A NORMAL KARYOTYPE  Phan Thi Xinh, Hoang Anh Vu   * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 ‐ Supplement of No 1 ‐ 2014: 232 ‐ 236  Background: The aim of this study is to establish a DNA sequencing procedure for detection of FLT3 gene  mutations in patients with acute myeloid leukemia (AML).  Methods: Bone marrow samples of 18 AML patients with a normal karyotype were used  for detection of  FLT3 mutations  from exons 14 to exon 20 at Blood Transfusion and Hematology Hospital  from May 2012 to  May 2013.  Result: We successfully amplified FLT3 exons 14 to 20 using a single primer pair, which facilitate detection  of almost all the known mutations in this gene. We found 9 mutations from 18 patients (50%), including 6 with  internal tandem duplications within exon 14 and 3 with point mutations within exons 16 and 20.  Conclusion: DNA sequencing for detection of FLT3 mutations was established at our hospital. This may  help to improve the prognostic classification for AML patients.  Key words: FLT3 gene, mutation, acute myeloid leukemia, karyotype.  ĐẶT VẤN ĐỀ  Bệnh  bạch  cầu  cấp  dòng  tủy  (BCCDT)  là  bệnh lý ác tính về máu, đặc trưng bởi sự tăng  sinh quá mức và không biệt hóa của các tế bào  tạo máu, gây  tích  tụ  tế bào non  trong máu và  trong  tủy xương. Về  lâm  sàng cũng như  sinh  học,  BCCDT  biểu  hiện  nhiều  thể  khác  nhau  gây khó khăn cho việc  tiên  lượng và điều  trị.  Nếu chỉ dựa vào các bất thường ở mức nhiễm  sắc  thể,  BCCDT  thường  được  phân  thành  nhóm tiên lượng tốt, tiên lượng trung bình hay  * Đại  học Y Dược TP.HCM  ** Bệnh viện Truyền máu Huyết học TP.HCM.  Tác giả liên lạc: TS.BS. Phan Thị Xinh   ĐT: 0932728115   Email: Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014  Nghiên cứu Y học Huyết Học 233 tiên  lượng  xấu(1,3).  Theo  cách  phân  chia  này,  những  bệnh  nhân  không  có  bất  thường  về  nhiễm sắc thể được cho là có tiên lượng trung  bình.  Tuy  nhiên,  các  nghiên  cứu  gần  đây  lại  cho  thấy  rằng  ngay  trong  nhóm  bệnh  nhân  không có bất thường NST thì tiên  lượng cũng  khác  nhau,  tùy  theo  bệnh  nhân  có  kèm  theo  các đột biến gen hay không.  Gen FLT3 nằm trên nhiễm sắc thể 13, mã hóa  cho thụ thể tyrosine kinase thuộc nhóm III. Đây  là một trong những gen thường bị đột biến nhất  trong  các  bệnh  lý  ác  tính  về máu(7).  Đột  biến  thường gặp nhất của gen FLT3 là sự nhân đoạn  nội tại (ITD: internal tandem duplication) thuộc  exon 14 hay exon 15 của vùng cận màng(1). Các  đột  biến  điểm  tại  codon  676  của  exon  16  hay  quanh  vùng  codon  835  của  exon  20  cũng  đã  được báo cáo trong BCCDT(5). Các đột biến gen  này là những đột biến tăng chức năng, góp phần  quan  trọng vào cơ chế bệnh  sinh  của BCCDT  bằng cách làm cho thụ thể FLT3 được hoạt hóa  liên tục, không còn phụ thuộc vào các phân tử  truyền  tín  hiệu  ngoại  bào  nữa.  Bệnh  nhân  BCCDT với nhiễm sắc thể bình thường nhưng  có mang đột biến gen FLT3  thì  được xếp vào  nhóm  tiên  lượng  xấu. Mặt  khác,  việc  ức  chế  hoạt tính của các protein FLT3 đột biến hứa hẹn  là một mô thức điều trị nhắm trúng đích phân tử  hiệu quả  trong  tương  lai(10). Chính vì  thế, khảo  sát  tình  trạng  đột biến gen FLT3  trở nên quan  trọng  trong  cả  tiên  lượng và  điều  trị  cho bệnh  nhân(8).  Chúng  tôi  tiến hành nghiên  cứu này nhằm  xây dựng quy trình xác định đột biến gen FLT3  và mô  tả  những  kết  quả  ban  đầu  trên  nhóm  BCCDT tại Bệnh viện Truyền Máu – Huyết Học  Thành phố Hồ Chí Minh.  ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU  Đối tượng  Khảo sát đột biến gen FLT3 được tiến hành  trên  18  mẫu  tủy  xương  của  bệnh  nhân  bị  BCCDT. Tất cả các bệnh nhân này không có bất  thường  của  bộ  nhiễm  sắc  thể  khi  phân  tích  nhiễm sắc thể đồ.   Phương pháp  RT–PCR  Mẫu tủy trong chống đông EDTA được xử  lý loại hồng cầu và RNA được tách chiết bằng  RNeasy mini Kit (Qiagen, Mỹ) theo hướng dẫn  của nhà sản xuất. RNA được đo nồng độ bằng  máy  quang  phổ  kế  spectrophotometer. DNA  bổ  sung  (complement DNA hay  cDNA)  được  tổng  hợp  từ  1  μg  RNA  với  bộ  hóa  chất  SuperScript™  II  Reverse  Transcriptase  (Invitrogen,  Mỹ).  Chất  lượng  cDNA  được  kiểm tra bằng cách khuếch đại đoạn cDNA của  gen  beta‐actin  dài  1180  bp.  Để  khuếch  đại  đoạn gen FLT3 từ exon 14 đến exon 20, chúng  tôi  thiết  kế  mồi  xuôi  FLT3‐F1  (5’‐  GACAACATCTCATTCTATGCAAC  ‐3’)  nằm  trên  exon  13  và  mồi  ngược  FLT3‐R1  (5’‐  TTAGCATCAACCGGAATGCC  ‐3’)  nằm  trên  exon  22  bằng  phần mềm Oligo  4.1,  dựa  trên  trình  tự  chuẩn  của  gen  FLT3 mang  accession  number  NM_004119  trong  GenBank.  Polymerase dùng  cho PCR  là Takara Taq HS  (Takara, Nhật  Bản). Chương  trình  luân  nhiệt  thực  hiện  trên  máy  GeneAmp  PCR  System  2720  (Applied  Biosystems, Mỹ)  trong  45  chu  kỳ với nhiệt độ bắt cặp là 60oC. Sản phẩm PCR  dài 1073 bp được phát hiện bằng điện di  trên  thạch  agarose  1,2%  có  nhuộm  ethidium  bromide,  tinh  sạch  bằng  QIAquick  Gel  extraction kit (Qiagen, Mỹ).  Giải trình tự chuỗi DNA  Thực  hiện  phản  ứng  cycle  sequencing  các  sản phẩm PCR đã được tinh sạch, theo hai chiều  xuôi  và  ngược  với  BigDye  Terminator  v3.1  (Applied  Biosystems,  Mỹ).  Sản  phẩm  sau  đó  được kết tủa bằng ethanol, hòa tan trong Hi‐Di  formamide, biến tính ở 960C trong 2 phút trước  khi làm lạnh đột ngột. Trình tự DNA được đọc  bằng máy ABI 3130 Genetic Analyzer, với POP‐7  polymer  và  capillary  50  cm  (Applied  Biosystems, Mỹ). Kết quả được phân  tích bằng  phần mềm SeqScape.  Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Chuyên Đề Nội Khoa 234 KẾT QUẢ  Để có thể khảo sát được các đột biến của gen  FLT3, trước tiên chúng tôi chọn khuếch đại vùng  mã hóa protein có chứa các exon  từ 14 đến 20.  Hình 1 cho  thấy sản phẩm PCR  tương ứng với  kích thước mong đợi là 1073 bp. Sản phẩm PCR  khi được giải  trình  tự đã cho kết quả phù hợp  với  gen  FLT3 mang mã  số  NM_004119  trong  GenBank. Việc khuếch đại thành công vùng gen  này  cho  phép  nhận diện  hầu  hết  các  kiểu  đột  biến điểm, mất đoạn hay chèn đoạn có  thể xảy  ra trên gen FLT3.  Hình 1: Khuếch đại vùng gen FLT3 chứa exon 14 – 20.  Kết quả giải trình tự DNA trên 18 bệnh được  trình bày  trong Bảng 1. Có 9 bệnh nhân mang  đột biến gen FLT3, gồm 6  đột biến nhân  đoạn  nội tại của exon 14 và 3 đột biến điểm trên exon  16 và 20 (Hình 2).  Hình 2: Hình ảnh các kiểu đột biến   Bảng 1: Tình trạng đột biến gen FLT3 trong các mẫu nghiên cứu   STT Mã số nghiên cứu Giới tính Tuổi Exon bị đột biến Kiểu đột biến 1 AML-02 Nam 46 Không đột biến 2 AML-08 Nam 10 14 p.E611_F612ins13 3 AML-22 Nữ 7 Không đột biến 4 AML-23 Nữ 37 Không đột biến 5 AML-44 Nam 2 20 p.D835H 6 AML-46 Nữ 34 14 p.W603_E604ins8 7 AML-47 Nữ 17 Không đột biến 8 AML-49 Nam 35 14 p.Y597_E598ins28 9 AML-51 Nam 23 Không đột biến 10 AML-52 Nam 14 16 p.N676K 11 AML-57 Nam 65 Không đột biến Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014  Nghiên cứu Y học Huyết Học 235 STT Mã số nghiên cứu Giới tính Tuổi Exon bị đột biến Kiểu đột biến 12 AML-61 Nam 41 Không đột biến 13 AML-78 Nam 53 14 p.V592_D593ins11 14 AML-79 Nam 68 14 p.Y597_E598ins8 15 AML-93 Nam 4 20 p.D835E 16 AML-94 Nam 11 Không đột biến 17 AML-95 Nam 54 Không đột biến 18 AML-104 Nam 52 14 p.F612_G613ins25 BÀN LUẬN  Các đột biến gen FLT3 vừa có ý nghĩa tiên  lượng,  vừa  là  đích  nhắm  phân  tử  hứa  hẹn  trong  nghiên  cứu  điều  trị  BCCDT(3,9). Nghiên  cứu này đã thành công trong việc xác lập quy  trình hoàn chỉnh để có thể xác định tình trạng  có hay không có  đột biến gen FLT3 cho bệnh  nhân  BCCDT  tại  Bệnh  viện  Truyền  Máu  –  Huyết Học Thành phố Hồ Chí Minh. Kết quả  ban  đầu  theo  dõi  bệnh  nhân  cho  thấy  tình  trạng  có  đột biến gen FLT3 phù hợp với  tiên  lượng xấu. Bệnh nhân  có mã  số AML‐08, với  kiểu  đột  biến  p.E611_F612ins13  của  exon  14,  không  đạt  được  lui bệnh  sau  đợt  điều  trị  tấn  công và đã tử vong. Trong tương lai, việc phát  hiện đột biến FLT3 bằng kỹ thuật giải trình tự  sẽ  giúp  chọn  giải  pháp  ghép  tủy  cho  những  trường  hợp  tiên  lượng  xấu  đã  đạt  được  lui  bệnh sau giai đoạn điều trị tấn công. Việc xác  định  được  tình  trạng  đột  biến  của  gen  FLT3  cũng cho phép chúng ta có thể chọn bệnh nhân  phù hợp tham gia các nghiên cứu thử nghiệm  lâm sàng quốc tế với các thuốc mới nhắm đến  FLT3 trong BCCDT.  Kỹ thuật giải trình tự DNA trong nghiên cứu  này  cho phép  khảo  sát  không  chỉ  riêng  rẽ  các  exon  14,  15  và  20  mà  toàn  bộ  vùng mã  hóa  protein  từ exon 14 đến 20,  tránh bỏ sót một số  đột biến mới. Bước  đầu khảo  sát  trên  18 bệnh  nhân,  chúng  tôi  phát  hiện  đột  biến  gen  FLT3  trong  50%  số  trường  hợp,  so  với  44%  trong  nghiên  cứu  của  Schlenk  và  cộng  sự  thực  hiện  trên 438 bệnh nhân(6). Hơn nữa, chúng  tôi phát  hiện một  trường  hợp  bệnh  nhân  có mang  đột  biến  điểm  của  exon  16  (p.N676K),  là  đột  biến  gần  đây  được  báo  cáo  trong  nghiên  cứu  của  Opatz  và  cộng  sự  khi  sử  dụng  hệ  thống  giải  trình tự thế hệ mới để tìm đột biến trên toàn bộ  các exon  trong bộ gen(4). Kết quả  cho  thấy quy  trình kỹ  thuật  của  chúng  tôi  trong nghiên  cứu  này đáng  tin cậy, có  thể ứng dụng để khảo sát  thêm với số mẫu  lớn hơn nhằm xác định được  tần suất và phổ đột biến của gen FLT3 trên bệnh  nhân Việt nam. Ngoài ra, cũng cần  lưu ý rằng,  ngoài đột biến gen FLT3 thì bệnh nhân BCCDT  với  bộ  nhiễm  sắc  thể  bình  thường  còn  có  thể  mang  các  đột  biến  gen  khác  cũng  ảnh  hưởng  đến  tiên  lượng  bệnh,  như  gen  NPM1  và  CEPBA(2,6). Trong thời gian tới, chúng tôi sẽ tiếp  tục  triển khai nghiên cứu đột biến các gen này  để có đầy đủ cơ sở phân nhóm tiên lượng chính  xác hơn cho bệnh nhân BCCDT.  KẾT LUẬN   Chúng  tôi  đã  thành  công  trong  việc  xây  dựng quy trình giải trình tự chuỗi DNA để xác  định  đột  biến  gen  FLT3,  giúp  tiên  lượng  bệnh  nhân BCCDT. Việc ứng dụng kỹ thuật này vào  lâm sàng có thể cải thiện hiệu quả điều trị trong  thời gian tới.  TÀI LIỆU THAM KHẢO  1. Breitenbuecher F, Schnittger S, Grundler R, Markova B, Carius  B, Brecht A, Duyster J, Haferlach T, Huber C, Fischer T (2009).  Identification  of  a  novel  type  of  ITD  mutations  located  in  nonjuxtamembrane  domains  of  the  FLT3  tyrosine  kinase  receptor. Blood 23;113(17):4074‐7.  2. Fasan A, Haferlach C, Alpermann T (2013). The role of different  genetic  subtypes  of  CEBPA  mutated  AML.  Leukemia  doi:  10.1038/leu.2013.273.  3. Mrozek K, Heerema NA, Bloomfield CD (2004). Cytogenetics in  acute leukemia. Blood Rev;18(2):115‐36.  4. Opatz  S,  Polzer H, Herold  T, Konstandin NP  (2013).  Exome  sequencing identifies recurring FLT3 N676K mutations in core‐ binding factor leukemia. Blood;122(10):1761‐9.  5. Renneville  A,  Roumier  C,  Biggio  V, Nibourel  O,  Boissel N,  Fenaux P, Preudhomme C (2008). Cooperating gene mutations  in acute myeloid leukemia: a review of the literature. Leukemia;  22(5): 915‐31.  Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Chuyên Đề Nội Khoa 236 6. Schlenk RF, Döhner K, Krauter J, Fröhling S (2008). Mutations  and treatment outcome in cytogenetically normal acute myeloid  leukemia. N Engl J Med; 358(18):1909‐18.  7. Stirewalt  DL,  Radich  JP  (2003).  The  role  of  FLT3  in  haematopoietic malignancies. Nat Rev Cancer;3(9):650‐65.  8. Su L, Gao  SJ, Li W, Tan YH, Cui  JW, Hu RP  (2013). NPM1,  FLT3‐ITD, CEBPA, and c‐kit mutations in 312 Chinese patients  with de novo acute myeloid leukemia. Hematology 2013 Oct 25  [Epub ahead of print].  9. Swords R, Freeman C, Giles F  (2012). Targeting  the FMS‐like  tyrosine  kinase  3  in  acute  myeloid  leukemia.  Leukemia;26(10):2176‐85.  10. Testa U, Pelosi E (2013). The Impact of FLT3 Mutations on the  Development  of  Acute  Myeloid  Leukemias.  Leuk  Res  Treatment 2013:275760.  Ngày nhận bài báo:       01/11/2013  Ngày phản biện nhận xét bài báo:   30/11/2013  Ngày bài báo được đăng:     05/01/2014