Kỹ thuật phân tíchprotein theo phương pháp protein array protein array technology

Kyõ thuaät Phaân tích Protein Theo Phöông phaùp Protein Array Protein Array Technology Ñaïi Hoïc Noâng Laâm, TP. Hoà Chí Minh Thaùng 10, 2007 Protein Array Technology • - Protein ñoùng vai troø to lôùn trong caùc döôïc phaåm chuyeân bieät. • Tuy nhieân, • - Nghieân cöùu DNA -> Heä di truyeàn vaø ñieàu hoaø phieân maõ, khoâng höôùng ñeán vai troø cuûa caùc Protein ñöôïc bieåu hieän. • - Ñieàu hoøa ôû möùc ñoä mRNA chæ laø moät khía caïnh cuûa quaù trình ñieàu hoaø sinh hoïc treân cô sôû ñaùp öùng veà chöùc naêng sinh hoïc. • - Caùc protein chöùc naêng trong moät cô theå >>> soá gen. • Ñeå hieåu ñöôïc taùc ñoäng giöõa vieäc bieåu hieän Protein vaø moái quan heä hoå töông vôùi chöùc naêng caàn thieát phaûi coù nhöõng nghieân cöùu tröïc tieáp vaán ñeà naøy. Protein Array Technology Ñaëc ñieåm protein vaø heä thoáng bieåu hieän • Protein ñöôïc hình thaønh coù nhieàu daïng caáu truùc vaø nhieàu ñaëc tính chi phoái chöùc naêng cuûa chuùng. • Caáu truùc khoâng gian 3 chieàu ñöôïc xaùc ñònh thoâng qua caùc trình töï axit amin vaø caùc traïng thaùi xung quanh. • Caùc thay ñoåi trong quaù trình dòch maõ taùc ñoäng ñeán söï gaén keát vaø chöùc naêng cuûa moät soá protein. + Söï Glycosyl hoùa aûnh höôûng ñeán tính tan, tuoåi thoï vaø hoaït tính cuûa moät soá protein nhö khaû naêng cuûa khaùng theå gaén vôùi boå theå. + Söï phosphoryl hoùa ñieàu hoøa caùc hoaït ñoäng enzyme vaø cho pheùp xaûy ra caùc töông taùc pro-pro thoâng qua caùc thuï theå nhaän bieát caùc phaân töû P. + Caùc thay ñoåi trong dòch maõ phuï thuoäc raát nhieàu vaøo quaù trình bieåu hieän cuûa teá baøo chuû. Neáu moät protein taùi toå hôïp ñöôïc bieåu hieän trong teá baøo vi khuaån thöôøng khoâng ñöôïc Glycosyl hay Phosphoril hoaù, nhöng teá baøo S. cerevisea laïi coù khaû naêng G-hoùa caùc protein tieát ra töø teá baøo ñoäng vaät coù vuù. Caùc protein caàu coù chöùa caùc phaàn kî nöôùc quay vaøo beân trong vaø beân ngoaøi, neáu söû duïng caùc dung moâi höõu cô hay caùc chaát coù tính chaát taåy röûa, caùc phaàn kî nöôùc beân trong seõ quay ra ngoaøi, laøm maát hoaït tính cuûa protein. Vieäc taùi taïo laïi protein ñaõ bieán tính in vitro laø moät coâng vieäc khoù khaên, ñoøi hoûi phaûi coù caùc phöông phaùp linh hoaït vaø khoù ñaït ñöôïc trong ña soá tröôøng hôïp. ----> Caàn thieát phaûi coù moät phöông phaùp thích hôïp trong nghieân cöùu protein veà chöùc naêng cuõng nhö laø moái töông quan veà caáu truùc. Protein Array Technology • Laø kyõ thuaät tieân tieán vaø hieäu quaû cao trong saøng loïc söï bieåu hieän protein teá baøo. • Coù theå duøng moät slide kính hieån vi hay caùc giaù theå daïng haït coù chöùa maãu khaùc nhau. • Nhuoäm slide hay haït ñeå phaùt hieän haøng ngaøn bieåu hieän khaùc nhau trong cuøng moät böôùc phaân tích töï ñoäng. • Phaùt hieän: töông taùc Pro-Pro, khaùng nguyeân- khaùng theå, Enzyme-cô chaát, DNA-Pro, Ligand- receptor. Protein Array Technology Kyõ thuaät array ñöôïc aùp duïng ñeå giaùm saùt cô cheá gen noäi baøo vaø bieåu hieän protein. DNA array: phaân tích di truyeàn cuõng nhö bieåu hieän ôû möùc mRNA. Protein Array: phaân tích ôû möùc ñoä protein vaø caùc töông taùc. Phaân tích so saùnh vaø ñònh löôïng Protein Phaân tích so saùnh vaø ñònh löôïng Protein • a) Phaân tích so saùnh genome vaø Proteome: caùc thaønh phaàn töông töï cuûa protein töø nhieàu nguoàn khaùc nhau ñöôïc phaân laäp vaø phaân tích. Caùc phaân töû ñöôïc ñaùnh daáu phaân bieät baèng ñoàng vò phoùng xaï hay nhuoäm huyønh quang. Caùc phaân töû ñích ñöôïc ñaùnh daáu ñaïi dieän cho caùc phenotype khaùc nhau trong hai maøu rieâng bieät. Söï khaùc bieät veà trình töï hay bieåu hieän coù theå ñöôïc kieåm tra nhôø söï phaân tích so saùnh khi söû duïng moät hoãn hôïp caùc phaân töû ñích ñöôïc ñaùnh daáu khaùc nhau. • b) Phaân tích ñònh löôïng ñoàng thôøi protein: Caùc protein ñöôïc ñaùnh daáu fluorochrome coù theå ñöôïc phaùt hieän ñoàng thôøi theo kyõ thuaät microarray. Caùc khaùng theå chuyeân bieät coá ñònh töông taùc vôùi caùc protein ñích töông öùng vôùi chuùng coù trong dung dòch. Maät ñoä tín hieäu coù ñöôïc töông öùng vôùi löôïng maãu ñöôïc gaén keát. Trong moãi array, coù theå coù caùc ñieåm ñoái chöùng khaùc nhau, nhö chöùng döông hay chöùng aâm, hoaëc caùc ñieåm hieäu chuaån. Ñieàu naøy cho pheùp ñònh löôïng chính xaùc caùc tín hieäu. Protein Array Technology • Caùc ñaëc tính cuûa caùc vaät lieäu laø pha raén hay loûng nhö ñieän tích, ñoä nhôùt, kích thöôùc loå maøng, pH, khaû naêng keát noái chuyeân bieät hay khoâng chuyeân bieät. . ., coù vai troø raát quan troïng trong vieäc taïo ra moät protein array. • Thaùch thöùc lôùn nhaát laø giöõ ñöôïc hoaït tính protein. Ñieàu naøy ñöôïc giaûi quyeát deã daøng neáu gaén ñònh höôùng protein leân moät vuøng coá ñònh, thoâng qua moät vuøng chuyeân bieät (nhö histidin tag) vaø cho pheùp vuøng hoaït tính hoaït ñoäng töï do thöïc hieän caùc töông taùc. Protein Array Technology • Protein array thöôøng ñöôïc phaân tích vaø quan saùt treân caùc thieát bò töï ñoäng hieän ñaïi. Thoâng thöôøng laø caùc heä thoáng döïa treân nguyeân lyù gaén keát. Söï gaén keát treân beà maët raén thöôøng khoâng nhaïy caûm ñoái vôùi söï bieán ñoåi ñoä nhôùt cuûa maãu. • Haàu heát caùc heä thoáng ghi hình aûnh cho Protein Array laø döïa treân söï phaùt quang, söû duïng quaù trình ñaùnh daáu tröïc tieáp leân ligand hay giaùn tieáp thoâng qua caùc khaùng theå ñöôïc ñaùnh daáu. Caùc phaân töû gaén keát duøng trong phaân tích protein array Ñeå phaân tích caùc töông taùc chuyeân bieät, nhieàu loaïi phaân töû ñöôïc coá ñònh treân beà maët phaúng ñeå phaûn öùng nhö laø caùc phaân töû gaén keát. a) Töông taùc khaùng nguyeân- khaùng theå. b) Mieãn dòch Sandwich. c) Töông taùc pro-pro. d) Caùc phaân töû aptamer toång hôïp. e) Enzyme-Cô chaát: cô chaát cho kinase ñöôïc coá ñònh vaø ñöôïc phosphoryl hoùa nhôø Kinase. f) Thuï theå-ligand: hôïp chaát toång hôïp coù phaân töû thaáp ñöôïc coá ñònh nhö laø phaân töû gaén keát. Taïi sao söû duïng kyõ thuaät naøy? • 1. Löôïng maãu caàn ít: –Moät soá maãu raát hieám: beänh phaåm, huyeát thanh chuoät.. 2. Löôïng thoâng tin thu nhaän ñöôïc raát lôùn töø moät maãu: - Giaûm ñaùng keå caùc thí nghieäm. - Thu ñöôïc toaøn boä thoâng tin töø moät thí nghieäm phaân tích. 3. Giaûm löôïng hoùa chaát söû duïng, nhaân coâng 4.Taïo ra ñöôïc nhieàu thoâng tin hoå töông giöõa caùc chaát caàn phaân tích. Kyõ thuaät Luminex Bead-based • Heä thoáng hoaït ñoäng nhö theá naøo? • - Phaûn öùng xaûy ra treân beà maët cuûa caùc haït polystyrene. • - Moãi haït được nhuộm với hai loaïi thuoác nhuoäm coù chöùa noàng ñoä khaùc nhau: ñoû vaø hoàng ngoaïi • - Haøng traêm haït ñöôïc ñaùnh daáu maøu rieâng: moãi maøu ñöôïc duøng cho moät phaûn öùng rieâng bieät. • Æ DÖÏA TREÂN MAØU CUÛA CAÙC HAÏT. Kyõ thuaät Luminex Bead- based • Heä thoáng hoaït ñoäng nhö theá naøo? • - Phaûn öùng xaûy ra treân beà maët cuûa caùc haït polystyrene. Kyõ thuaät Luminex Bead-based • Heä thoáng hoaït ñoäng nhö theá naøo? • - Moãi haït coù chöùa noàng ñoä khaùc nhau cuûa hai loaïi thuoác nhuoäm: ñoû vaø hoàng ngoaïi • - Haøng traêm haït ñöôïc ñaùnh daáu maøu rieâng: moãi maøu ñöôïc duøng cho moät phaûn öùng rieâng bieät. • Æ DÖÏA TREÂN MAØU CUÛA CAÙC HAÏT. Kyõ thuaät Luminex Bead-based vaø Kyõ thuaät ELISA thoâng thöôøng • Kyõ thuaät ELISA thoâng thöôøng phaân tích cuøng luùc treân nhieàu gieáng moät chæ tieâu. • Ñöôïc thöïc hieän treân caùc plaque 96 gieáng. Kyõ thuaät Luminex Bead-based vaø Kyõ thuaät ELISA thoâng thöôøng • Kyõ thuaät Bead Arrays cho pheùp phaân tích cuøng luùc nhieàu chæ tieâu treân cuøng moät gieáng hay moät oáng nghieäm. • Ñöôïc thöïc hieän treân caùc haït nhuoäm maøu coù gaén keát caùc thuï theå ñaëc hieäu. Kyõ thuaät Luminex Bead- based • Kyõ thuaät Bead Arrays duøng caùc haït ñöôïc maõ hoùa bôûi maøu baèng caùch söû duïng moät daõy caùc tín hieäu huyønh quang khaùc nhau cuûa hai maøu nhuoäm. Kyõ thuaät Protein Array 100 maøu ñaùnh daáu = 100 pheùp thöû ñoàng thôøi Kyõ thuaät Bio-Plex Protein Array (Bead-based assay) Söû duïng moät loaïi haït hình caàu (hay slide) ñeå xaùc ñònh ñoàng thôøi nhieàu phaûn öùng trong cuøng moät oáng nghieäm hay gieáng nhoû coù chöùa maãu. Böôùc ñaàu tieân: - Taùc nhaân doø ñöôïc gaén treân beà maët cuûa caùc haït polystyrene. - Bio-Plex söû duïng khaùng theå (antibody), Oligonucleotides. laøm taùc nhaân doø Kyõ thuaät Bio-Plex Protein Array (Bead-based assay) Sau ñoù troän laãn taát caû caùc loaïi haït vôùi nhau: -Moãi haït maøu ñöôïc gaén loaïi taùc nhaân doø khaùc nhau. - Ñaây goïi laø Multiplexing. Kyõ thuaät Bio-Plex Protein Array (Bead-based assay) Gaén keát vôùi caùc phaân töû doø vôùi maãu baèng caùch troän vôùi maãu caàn phaân tích Böôùc thöù hai: - Troän caùc haït coù ñaàu doø vôùi maãu. - Caùc maãu ñích seõ gaén vôùi ñaàu doø vaø ñöôïc ñính treân caùc haït. Kyõ thuaät Bio-Plex Protein Array (Bead-based assay) Böôùc thöù ba: - Boå sung maãu doø thöù hai đặc hiệu coù gaén ñuoâi (tag) huyønh quang. Kyõ thuaät Bio-Plex Protein Array (Bead-based assay) Böôùc thöù tö: Phaùt hieän caùc haït trong doøng löu chaát qua heä thoáng ñoïc keát quaû (Array Reader) Moät heä löu chaát cho pheùp caùc haït ñi qua trình töï, vaø ñi qua caùc aùnh saùng laser. vaø phaùt hieän treân doøng chaûy Phaùt hieän qua Flow fluorescence - Caùc haït ñöôïc ñöa vaøo dung dòch loûng - Töøng haït ñöôïc chaïy qua aùnh saùng Laser - AÙnh saùng phaân taùn vaø phaùt ra huyønh quang. - AÙnh saùng huỳnh quang ñöôïc haáp thu vaø loïc. - Tín hieäu saùng ñöôïc chuyeån thaønh giaù trò soá hoïc. - Löu tröõ treân maùy tính. Kyõ thuaät Bio-Plex Protein Array (Bead-based assay) Phaùt hieän: Tags ñöôïc kích thích - Döõ lieäu ñöôïc thu thaäp laø Ñoä nhaïy huyønh quang (Fluorescent Intensity-FI) - Ñoä nhaïy cuûa tín hieäu bieåu thò cho löôïng maãu ñích coù trong maãu. Kyõ thuaät Bio-Plex Protein Array (Bead-based assay) Phaùt hieän: Caùc chaát nhuoäm coù trong haït caàu ñöôïc kích thích. - Soá löôïng cuûa moãi thuoác nhuoäm ñöôïc ñònh löôïng. - Caùc haït ñöôïc ñöa vaøo caùc vuøng khaùc nhau döïa treân maøu (Classification). -Moãi keát quaû huyønh quang cuûa haït ñöôïc phaân loaïi (Classification). Kyõ thuaät Protein Array 100 maøu ñaùnh daáu chæ laø böôùc khôûi ñaàu Neáu söû duïng 3, 4, 5, maøu ??? Thu thaäp döõ lieäu • Array Reader (Bio-Plex Reader) thu nhaän döõ lieäu: • - Döõ lieäu ñöôïc chuyeån sang daïng baûng Excel. • - Bao goàm döõ lieäu phaân tích vaø döõ lieäu xaùc nhaän tính chính xaùc. Kỹ thuật BioPlex và các kỹ thuật truyền thống • Hiện nay kỹ thuật Bio-Plex assays dùng nguyên lý mễn dịch, tương tự như ELISA để giảm thiểu khả năng phản ứng chéo bởi vì để phát hiện kháng thể thừ 2 phải nhận biết được epitope thứ hai trên target. • Vì vậy kỹ thuật Xmap bead assays chuyên biệt hơn các kỹ thuật phương pháp bắt giữmột kháng thể đơn (Westerns) Kỹ thuật BioPlex và các kỹ thuật truyền thống • Tuy nhiên kỹ thuật xMAP có độ khỏang hoạt động lớn hơn kỹ thuâậ ELISA rất nhiều. • Và có thể phân tích đến hàng trăm chỉ tiêu cùng lúc trong một mẫu trên một ống nghiệm. Bio-Plex là kỹ thuật Multiplex ELISA • N/c các đáp ứng viêm nhiễm (cytokine research) • Cho phép phát hiện cùng lúc hàng trăm chỉ tiêu trong cùng một giếng mẫu. • Cần lượng mẫu bệnh phẩm ít hơn • Khỏang họat động rộng • Gia tăng độ nhạy Bio-Plex là kỹ thuật Multiplex Western Blot • Cho phép phát hiện cùng lúc hàng trăm chỉ tiêu trong cùng một giếng mẫu. • Độ lập lại cao • Không cần nhiều mẫu • Chuyên biệt cao hơn Western Blot Kyõ thuaät Protein Array • CAÙC ÖÙNG DUÏNG TRONG NGHIEÂN CÖÙU: • 1. Laäp hoà sô bieåu hieän Protein (Protein Expression Profile) – Truyeàn tín hieäu trong teá baøo. – Phaùt hieän tín hieäu Cytokine noäi vaø ngoaïi baøo. 2. Nghieân cöùu caùc thay ñoåi sau dòch maõ (Postranslational modifications) – Quaù trình phosphoryl hoùa. 3. Ñònh löôïng protein. 4. Xét nghiệm các bệnh, SNPs, đột biến, marker ung thư . Kyõ thuaät Protein Array • THIEÁT BÒ HIEÄN ÑAÏI DUØNG TRONG PROTEIN ARRAY Bio-Plex Workstation Bio-PlexWorkstation 1. Protein Array reader - Ñöôïc xaùc ñònh ñoä chính xaùc vôùi coâng cuï Validation. 2. Microplate Platform 3. Maùy tính - Pentum 4, windows 2000, office 2000, XP, XP pro - Maøn hình phaúng NEC 4. Heä thoáng HTS (High Throughput fluidics) 5. Thanh load maãu 6. Ñóa MCV (Maintenance, Calibration, Validation) Bio-Plex Workstation 6. Ñóa CMV - Ñóa chuyeân duïng ñaëc bieät 96 gieáng - Duøng cho baûo döôõng, hieäu chuaån, xaùc nhaän ñoä chính xaùc ñònh kyø Moät soá öùng duïng thöïc teá cuûa Protein Array Technology 1. Genomics 2. Proteomics 3. Chaån ñoaùn laâm saøng (Clinical diagnostics) Moät soá öùng duïng thöïc teá cuûa Protein Array Technology 1. Genomics -Xaùc ñònh kieåu di truyeàn (Genotyping) * Ña hình (Gene polymorphism) * Ñoät bieán gene (Gene mutation) -Bieåu hieän gene (Gene expression) * Chæ thò beänh (Disease markers) *Quaù trình phaùt trieån (Developmental Processes) * Ñieàu hoøa gene (Gene regulation) Moät soá öùng duïng thöïc teá cuûa Protein Array Technology 2. Proteomics -Laäp hoà sô protein (Protein profiling) * Multiplex Cytokine assays: cell culture, serum, plasma, hay dòch trích töø moâ, coù ñoâ nhaïy vaø chuyeân bieät töông ñöông ELISA. -Caùc thay ñoåi sau dòch maõ (Posttranslational modifications) * Protein truyeàn tín hieäu (Signal transduction proteins) -Töông taùc vaø chöùc naêng protein (Protein function and interaction) * Gaén keát thuï quan vaø ligand * Hoaït tính enzyme * Töông taùc Protein-Protein * Epitope mapping Moät soá öùng duïng thöïc teá cuûa Protein Array Technology 3. Chaån ñoaùn laâm saøng (Clinical diagnostics) -Chaån ñoaùn phaân töû (Molecular diagnostic) * Kieåu di truyeàn SNP (SNP Genotyping) * Phaùt hieän caùc ñoät bieán gaây beänh (Detection of diseases-related mutations) * Kieåm tra HLA (HLA testing) -Mieãn dòch chaån ñoaùn multiplex (Multiplex diagnostic immunoassays) * Laäp ngaân haøng maùu (Blood banking) * Kieåm tra caùc beänh laây nhieãm (Infectious disease testing) * Kieåm tra hieäu löïc vaccine (Vaccine efficacy testing) * Kieåm tra töï mieãn dòch (Autoimmune testing) * Kieåm tra dò öùng (Allergic testing) * Phaùt hieän caùc chæ thò sinh hoïc (Biomarker detection) Bio-Plex Protein Assays • 1. Cytokine Assays • 2. Phosphoprotein Assays • 3. HLA Testing • 4. Bio-Plex Cytokine Assay • Cytokine: • - Nhoùm roäng caùc protein vaø peptide tan coù lieân quan ñeán quaù trình ñieàu hoøa heä mieãn dòch. • - Coù raát ít trong cô theå picogam/ml. • - Ñöôïc tieát ra do moät soá teá baøo nhaát ñònh (do stress) vaø gaây neân moät soá bieán ñoåi trong teá baøo khaùc (imflammation-söï vieâm nhieãm). • - ÔÛ möùc ñoä naøo ñoù, Cytokine raát gioáng hormon nhöng hormon chæ taùc ñoäng teân teá baøo chuyeân bieät, coøn Cyt. coù aûnh höôûng treân nhieàu teá baøo khaùc nhau. Bio-Plex Cytokine Assay • Hai lyù do ñeå quan taâm ñeán Cytokine: • 1. Hieåu cô cheá caùc beänh (nhö chöùng thaáp khôùp. . .). • 2. Hieåu caùc taùc ñoäng cuûa caùc taùc nhaân beân ngoaøi (lieäu phaùp thuoác) leân caùc teá baøo ñích ñeå ñaûm baûo phaûn öùng inflammatory khoâng xaûy ra. Bio-Plex Cytokine Assay Ñöôïc thieát keá ñeå xaùc ñònh ñònh löôïng nhieàu loaïi Cytokine Coù trong huyeát thanh, dòch nuoâi caáy teá baøo. Coù theå profile möùc ñoä ña daïng cytokine trong voøng 3 giôø Duøng kyõ thuaät kieåm tra treân ñóa 96 gieáng 12µl huyeát thanh hay 50µl dòch nuoâi caáy teá baøo Nguyeân lyù Bio-PlexCytokine Assays Laøm theá naøo thöïc hieän? 1. Hoaøn nguyeân maãu chuaån ñeå xaây döïng ñöôøng chuaån 2. Cho caùc bead, chuaån vaø maãu caàn phaân tích vaøo ñóa 96 gieáng. 3. UÛ, röûa vaø boå sung khaùng theå phaùt hieän 4. UÛ, röûa vaø boå sung streptavidine-phycoerythrin, röûa 5. Ñoïc keát quaû treân heä thoáng Array Reader. Cytokine Assay vs. ELISA 1. Nguyeân lyù töông töï nhö ELISA - ELISA, khaùng theå gaén keát coá ñònh treân ñaùy cuûa ñóa. - Bio-Plex, treân haït polystyrene trong dung dòch. 2. Khaùc nhau trong phaùt hieän - ELISA, duøng enzyme coäng hôïp ñeå phaùt hieän khaùng theå vaø cô chaát laø dung dòch phaûn öùng. - Bio-Plex, ñuoâi huyønh quang treân Streptavidine, phaùt huyønh quang tröïc tieáp. Khoâng coù cô chaát vaø yeâu caàu khoâng coù caùc taùc duïng phuï töø cô chaát Cytokine Assay vs. ELISA 3. Cytokine Assay cho nhieàu keát quaû hôn - Ñoä nhaïy töông ñöông hay cao hôn - Keát quaû tin caäy hôn * Huyønh quang tröïc tieáp * ELISA duøng enzyme vaø cô chaát, töøng cô chaát trong moãi laàn saûn xuaát???? - Moãi maãu ñöôïc thöïc hieän nhieàu laàn, duøng ít maãu vôùi Bio-Plex ñeå coù keát quaû mong muoán Cytokine Assay vs. ELISA 3. Cytokine Assay töông ñoàng vôùi ELISA - Keát quaû töông töï nhöng khoâng gioáng hoaøn toaøn * ELISA khaùc nhau theo töøng lot, do moãi khaùng theå laø khaùc nhau. * Bio-Plex cuõng laø moät phöông phaùp kieåm döïa treân khaùng theå nhöng coù ñoä tin caäy cao khi coù caùc coâng cuï calibration vaø validation. Bio-Plex Cytokine Assay Ñöôïc thieát keá ñeå xaùc ñònh löôïng nhieàu loaïi Cytokine coù trong huyeát thanh, dòch nuoâi caáy teá baøo. Coù theå profile möùc ñoä ña daïng cytokine trong voøng 3 giôø Duøng kyõ thuaät kieåm tra treân ñóa 96 gieáng 12µl huyeát thanh hay 50µl dòch nuoâi caáy teá baøo Bio-Plex Phosphoprotein Assays • Pheùp kieåm caùc protein bò Phosphoryl hoùa Bio-Plex Phosphoprotein Assays 1. Caùc phöông phaùp coå ñieån - Kieåm tra caùc enzyme kinase in vitro * Immunoprecipitation (keát tuûa mieãn dòch?) * ñaùnh daáu phoùng xaï P32 * SDS-PAGE - Western Blot 2. Kyõ thuaät hieän ñaïi (Multiplex) - Bio-Plex Protein Array system Bio-Plex Phosphoprotein Assays • Quaù trình phosphoryl hoùa ñoùng vai troø quan troïng trong con ñöôøng truyeàn tín hieäu ôû nhieàu möùc ñoä khaùc nhau, töø vieäc hoaït hoùa caùc thuï theå beà maët ñeán vieäc hoaït hoùa caùc yeáu toá phieân maõ. • Trong nghieân cöùu quaù trình truyeàn tín hieäu noäi baøo, ñieàu quan troïng laø phaùt hieän ñöôïc tình traïng phosphoryl hoùa cuûa caùc protein ñích, coù lieân quan tröïc tieáp ñeán hoaït tính cuûa chuùng. Bio-Plex Phosphoprotein Assays Khi quan taâm ñeán quaù trình truyeàn tín hieäu: - quan taâm ñeán vieäc laøm theá naøo caùc phaân töû töông taùc vôùi nhau trong vaø ngoaøi teá baøo, - ñeå phaùt hieän ñieàu gì kích thích hay öùc cheá chöùc naêng cuûa protein, vaø - ñeå ñuùc keát laïi raèng laøm theá naøo maø caùc phaân töû ñöôïc keát noái trong caùc con ñöôøng truyeàn tín hieäu. Bio-Plex Phosphoprotein Assays Kinase: - Moät nhoùm protein tín hieäu coù beân trong teá baøo - >500 kinase ñaõ ñöôïc khaùm phaù ñeå maõ hoùa cho boä gene ngöôøi - Khi K nhaän ñöôïc tín hieäu kích thích töø phaân töû tröôùc -> hoaït hoùa->phosphoryl hoùa protein tieáp theo. Ñieàu naøy gaây neân “doøng thaùc” caùc töông taùc phaân töû beân trong teá baøo. => Cô cheá naøy coù lieân quan ñeán haàu heát caùc maët trong sinh lyù teá baøo bao goàm caû taêng tröôûng, bieät hoùa vaø söï cheát cuûa teá baøo. Cô cheá cuûa söï Phosphoryl hoùa Moãi TKR coù moät ñuoâi kinase (phosphoryl hoùa protein treân tyrosine), moät ñaàn gaêùn hormon, vaø moät ñoaïn coù ñuoâi carboxyl coù nhieàu tyrosines ñeå töï phosphoryl hoùa Khi hormon gaén vaøo phaàn beân ngoaøi teá baøo, caùc thuï theå seõ tuï taäp laïi. Cô cheá cuûa söï Phosphoryl hoùa Cô cheá cuûa söï Phosphoryl hoùa Cô cheá cuûa söï Phosphoryl hoùa Cô cheá cuûa söï Phosphoryl hoùa Cô cheá cuûa söï Phosphoryl hoùa Cô cheá cuûa söï Phosphoryl hoùa Cô cheá cuûa söï Phosphoryl hoùa Bio-Plex Phosphoprotein Assays Caùc baát thöôøng trong truyeàn tín hieäu gaây neân nhieàu loaïi beänh nhö ung thö, imflammatory. -> Caàn nghieân cöùu caùc aûnh höôûng cuûa quaù trình phosphoryl hoùa. Coù theå ño ñöôïc laøm theá naøo moät tín hieäu ñöôïc chuyeån töø moät K cho moät phaân töû khaùc. Nhu caàu thöïc teá laø toái ña hoùa thoâng tin thu nhaän ñöôïc töø moät maãu ⇒CaÀn thieát giaùm saùt laøm theá naøo coù nhieàu K ñaùp öùng vôùi moät kích thích hay öùc cheá trong cuøng moät maãu Bio-Plex Phosphoprotein Assays • Nguyeân lyù Haït gaén keát khaùng theå coäng hôïp ñöôïc uû vôùi dòch trích teá baøo Protein gaén keát treân haït ñöôïc uû vôùi khaùng theå phaùt hieän chuyeân bieät cho biotinylate-phospho Phöùc hôïp mieãn dòch ñöôïc ñöôïc ñaùnh daáu vôùi streptavidin-PE vaø ñöôïc phaùt hieän bôûi heä thoáng Bio-Plex Bio-Plex Phosphoprotein Assays • Phöông phaùp Raát gioáng Cytokine assay - Phospho ñöôïc uû qua ñeâm * thôøi gian daøi hôn! - Phospho khoâng coù chuaån ñeå hoøa tan hay kieåm chöùng * Khoâng coù ñöôøng cong ñònh löôïng nhö ôû Cytokine * Tính theo tæ leä vaø theo nhoùm treân ñóa ñaõ caøi ñaët Bio-Plex Phosphoprotein Assays Xét nghiệm HLA Human Lymphocyte Antigens • HLA là một hệ thống chỉ thị được tìm thấy trong hầu hết các tế bào trong cơ thể trợ giúp cho hệ miễn dịch trong quá trình nhận dạng các kháng thể tự thân và không tự thân. • Các gene mã hóa cho HLA được tìm thấy trong vùng gene nằm trên cánh ngắn của Chromosome số 6. Sự khác biệt trên các gene này chính là tính đa hình đại diện cho hàng ngàn bắt cặp của các allele. Xét nghiệm HLA Human Lymphocyte Antigens • HLA được kiểm tra dựa trên huyết thanh học bằng cách xác định các kháng nguyên tương tác với các kháng thể đã biết. • Các phương pháp trước kia sử dụng các đọan đa hình giới hạn, nhưng kể từ khi kỹ thuật PCR ra đời đã nhanh chóng thay thế. • Thuận lợi của kỹ thuật phân tử đã cung cấp một cách nhìn ở mức độ DNA phân tử để xác định các mã di truyền của HLA. HLA Typing bằng chẩn đoán phân tử • Cải thiện tính ổn định của mẫu xét nghiệm vì không cần thiết phải có các lymphocyte nguyên vẹn. • Gia tăng độ chính xác: rất ít các antigens bị mất đi hay xác định nhầm (mistyped) hay cho kết quả không rõ ràng. • Cho kết quả tốt đối với các lọai HLA khó: Các xét nghiệm dùng các hóa chất tổng hợp và có thể phát hiện đựơc trong trường hợp có các antisera hiếm. • Gia tăng tính lập lại giữa các thí nghiệm • Kiểm tra chất lượng tốt hơn: Các mẫu chuẩn DNA được dùng trong thống kê tính chính xác. Xét nghiệm HLA bằng kỹ thuật phân tử trên hệ thốngBio-Plex • Nguyên tắc tương tự như các phương pháp sinh học phân tử khác. • Sử dụng kỹ thuật Tem-PCR (Target Enriched Multiplex PCR và kỹ thuật xMAP để phát hiện đồng thời hàng trăm HLA đích trên cùng một phản ứng. Các thuận lợi của xét nghiệmHLA trên hệ thống Bio-Plex • Multiplexing: Trong mỗi lần xét nghiệm chỉ cần sử dụng một lượng rất nhỏ mẫu bệnh phẩm nhưng cho phép phát hiện đến 100 chỉ tiêu. • Nhanh chóng: Toàn bộ xét nghiệm có thể hoàn tất trong trong thời gian < 3 giờ, một kỹ thuật viên có thể làm hàng trăm mẫu/ ngày. • Chuyên biệt và độ nhạy cao: Sự kết hợp của 2 kỹ thuật PCR và xMAP làm gia tăng vượt trội tính chuyên biệt và độ nhạy trong phát hiện. • Giảm giá thành trên mỗi test: Nhân lực và hóa chất giảm đáng kể nhờ khả năng phát hiện hàng loạt và hệ thống tự động. SNP site Ligase Capture Probe Reporter Probe A T T T Oligonucleotide Ligation Assay (OLA) ZipCode cZipCode Spacer DNA polymerase Capture Probe 1 labeled ddNTP 3 unlabeled ddNTPs ZipCode cZipCode Spacer SNP site A T A G C T T The labeled base that is incorporated identifies SNP Single Base Chain Extension (SBCE) / Minisequencing Capture Probe DNA polymerase 1 labeled dNTP 3 unlabeled dNTPs ZipCode 1 ZipCode 2 cZipCode 1 cZipCode 2 Spacer SNP site A T C C T C T Allele-Specific Primer Extension (ASPE) The capture probe has specificity for SNP site; no basepair match at the last base Æ no extension Protein Array Technology • Kieán thöùc caàn nhôù! • Things to remember!