Một số đặc điểm vi rút học của vi rút cúm a/h1n1/09 đại dịch tại Việt Nam, 2009 - 2013

rút nghiên cứu P83S và I321V (100%). Đột biến S203T đƣợc xác định trong hầu hết các nhóm/phân nhóm từ 2-7, với tần suất 87,5% (7/8 nhóm/phân nhóm), các thay đổi R223Q, E374K cũng xuất hiện với tần suất đạt 50% (4/8 nhóm/phân nhóm) và D97N, S451N đƣợc xác định 37,5% (3/8 nhóm/phân nhóm), trong khi một số axit amin thay đổi (đột biến) khác xuất hiện đơn lẻ tại 1-2 nhóm/phân nhóm vi rút (bảng 3.4). Kết quả trên cho thấy một số đột biến đƣợc duy trì trong quá trình nhân lên và tái tạo các thế hệ vi rút A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Việt Nam trong các năm tiếp theo (ví dụ: P83S và I321V) và cũng tƣơng đồng với sự thay đổi của các chủng A(H1N1)pdm09 trong khu vực và trên thế giới. Ngoài ra đột biến có thể sẽ làm thay đổi kiểu hình (chức năng) của vi rút nhƣ G155E, N156K, D222N đã xuất hiện trên các chủng cúm trong nghiên cứu. 103 Protein HA của vi rút cúm thực hiện các hoạt động chức năng thông qua 5 khu vực kháng nguyên miễn dịch chính: Sa, Sb, Ca1, Ca2 và Cb, có vai trò trong đáp ứng miễn dịch của vật chủ, khởi động sự sản xuất kháng thể bảo vệ kháng vi rút cúm. Sự thay đổi (đột biến) tại các khu vực kháng nguyên hoặc trên bề mặt protein HA có thể gây ảnh hƣởng quan trọng tới sự nhận dạng kháng thể, cho phép vi rút trốn khỏi ảnh hƣởng của đáp ứng miễn dịch [8], [22], [95]. Tuy nhiên, hiện tại vi rút cúm A(H1N1)pdm09 đƣợc phân chia thành nhiều nhóm gen nhƣng đều có biểu hiện một số thay đổi axit amin trên protein HA tại các khu vực kháng nguyên Sa (N125D, K163T và S162H), Sb (S185T và A186T), Ca1 (S203T và R205K) và Ca2 (A141S), những thay đổi này không tạo sự thay đổi về đặc tính kháng nguyên của vi rút so với vi rút gốc (vắc xin) A/California/07/09 trong phản ứng HI khi sử dụng kháng huyết thanh chồn sƣơng [118], [124]. Trong kết quả nghiên cứu này, các thay đổi axit amin trên protein HA có tần suất xuất hiện cao (50% - 100%) đƣợc ghi nhận trong các vi rút cúm A(H1N1)pdm09 là P83S, I321V, S203T, D97N, R223Q và E374K (bảng 3.4), các thay đổi nằm ngoài khu vực kháng nguyên (trừ S203T), vì vậy không ảnh hƣởng tới khả năng tạo đáp ứng miễn dịch với vật chủ. Trong nghiên cứu, chúng tôi phát hiện sự thay đổi tại vị trí 155, 156 trên protein HA (G155E, N156K) trên 04 vi rút phân lập năm 2013 và 01 vi rút phân lập năm 2011 khi phân tích trình tự axit amin protein HA của 75 chủng vi rút. Các đột biến này nằm giữa các axit amin trong khu vực kháng nguyên Sa (N125D, K163T và S162H), tuy không gây sự thay đổi về đặc tính kháng nguyên của vi rút mang đột biến nhƣng theo các tài liệu của Mỹ, Nhật những thay đổi này có thể làm giảm làm giảm khả năng tƣơng tác với kháng huyết thanh chồn sƣơng trong phản ứng HI (HI = 320) thấp hơn 4 bậc khi so sánh với vi rút gốc A/California/07/09 (bảng 3.9) [23], [36], [47]. Ngoài ra, đột 104 biến tại vị trí D222N trên protein HA cũng đƣợc phát hiện một chủng vi rút phân lập năm 2013, đột biến này liên quan đến sự tăng tiến triển nặng của bệnh nhân nhiễm cúm A(H1N1)pdm09 [8], [11]. Vi rút cúm A(H1N1)pdm09 cũng giống các vi rút cúm mùa A/H3N2 hoặc B thông thƣờng gây bệnh nhẹ tại đƣờng hô hấp trên và đƣợc xác định “xu hƣớng” gắn vào thụ cảm thể tế bào chủ thông qua cầu axit sialic gắn liên kết với galactose bởi liên kết α2,6 (SAα2,6) có nhiều trong tế bào biểu mô đƣờng hô hấp trên, trong khi phần lớn vi rút cúm gia cầm có “xu hƣớng” gắn bám theo kiểu SAα2,3 và thụ cảm thể của tế bào đƣờng hô hấp dƣới tƣơng thích với kiểu gắn bám này. Độc lực của vi rút cúm phụ thuộc vào khả năng gây bệnh thông qua các protein vi rút và đáp ứng miễn dịch của vật chủ bao gồm cả miễn dịch bẩm sinh, miễn dịch thu đƣợc trong quá trình sống. Trong một số nghiên cứu đặc biệt là nghiên cứu trên vi rút cúm gia cầm A/H5N1, A/H7N9..., độc lực của vi rút đƣợc xác định bởi một số các axit amin dƣ tại khu vực phân tách protein HA1 và HA2 hoặc một số axit amin đặc biệt tại protein PB2, NS1.... Tuy nhiên không giống các vi rút cúm gia cầm, vi rút cúm A(H1N1)pdm09 chƣa đƣợc ghi nhận các “dấu ấn” cụ thể liên quan đến độc lực của vi rút. Với vi rút cúm ngƣời, vị trí biểu hiện độ đặc hiệu và ái tính của protein HA (Receptor binding site –RBS) với thụ cảm thể vật chủ là một trong những yếu tố quyết định sự tiếp nhận và lan truyền của vi rút cúm, có thể đánh giá là biểu hiện độc lực của vi rút. Sự thay đổi axit amin tại vị trí gắn thụ cảm thể của vi rút cúm là dấu hiệu cảnh báo sự thay đổi tƣơng thích của vi rút cúm và tế bào chủ. Đột biến D222G/N/E trên protein HA đã đƣợc ghi nhận tại Mỹ và Nauy, là “dấu hiệu” độc lực tiềm tàng của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 liên quan đến các biểu hiện nặng trên lâm sàng [8], [11]. Đột biến này đƣợc chứng minh là nguyên nhân của sự giảm ái lực gắn bám của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 với thụ cảm thể 105 SAα2,6 và tăng khả năng gắn bám với thụ cảm thể SAα2,3. Sự hiện diện của các thụ cảm thể SAα2,3 tại phế nang của phổi có thể giải thích cho tiến triển viêm phổi nặng do vi rút cúm sẽ dễ dàng tiếp cận và nhân lên tại khu vực đƣờng hô hấp dƣới, các biểu hiện lâm sàng đƣợc ghi nhận giống nhƣ các trƣờng hợp nhiễm cúm A/H5N1 từng biết. Các đột biến khác D222E và D222N trên protein HA cũng đƣợc ghi nhận trên vi rút cúm A(H1N1)pdm09 và cũng liên quan đến tiến triển nặng của bệnh nhƣ đột biến D222G, tuy nhiên đột biến D222E không đƣợc ghi nhận là đột biến đặc hiệu liên quan đến tiến triển nặng, khi đột biến này có thể phát hiện trong cả trƣờng hợp biểu hiện nhẹ [12], [69], [72], [73], [87], [104], [105]. Kết quả điều tra hồi cứu bệnh nhân mang vi rút đột biến D222N trong nghiên cứu của chúng tôi cho thấy: bệnh nhân vào viện 24/11/2013 có biểu hiện viêm phổi nặng đã đƣợc điều trị thuốc kháng vi rút oseltamivir và kháng sinh đặc hiệu tại khoa điều trị tích cực, Bệnh viện Bạch Mai - Hà Nội nhƣng bệnh nhân vẫn tiến triển nặng và tử vong sau 7 ngày nhập viện với biểu hiện suy đa tạng. Đây là trƣờng hợp đầu tiên phát hiện đột biến D222N liên quan đến tiến triển nặng và tử vong của bệnh nhân nhiễm cúm A(H1N1)pdm09 tại Việt Nam, tuy nhiên số tử vong do nhiễm vi rút cúm này ghi nhận không ít (66 trƣờng hợp) từ 7/2009-7/2011. Vì vậy việc giám sát vi rút học cúm A(H1N1)pdm09 đặc biệt các đột biến axit amin tại vị trí D222G/N/E, G155E, N156K là rất cần thiết. Kết quả giám sát có thể cung cấp các thông tin cảnh báo đến các bác sỹ lâm sàng, giúp định hƣớng phác đồ điều trị hiệu quả và đặc biệt giám sát sự lan truyền của các đột biến nguy hiểm này trong quần thể vi rút cúm A(H1N1)pdm09, từ đó đánh giá nguy cơ tăng độc lực của vi rút và phát triển các biện pháp điều trị, dự phòng hiệu quả. 106 4.5.2. Protein NA. Cũng nhƣ protein HA, protein NA cũng là một kháng nguyên bề mặt của vi rút cúm, với bản chất là enzyme có vai trò trong việc làm loãng chất nhầy ở đƣờng hô hấp, nhờ đó làm cho vi rút tiếp xúc với tế bào niêm mạc và xâm nhập vào bên trong tế bào dễ dàng hơn. Hơn nữa, enzyme này còn giúp cho việc phá vỡ liên kết giữa vi rút đƣợc nhân lên và tế bào chủ giải phóng các vi rút ra khỏi tế bào nhiễm. Dựa vào các hoạt động chức năng của protein NA, thuốc kháng vi rút oseltamivir, zanamivir đƣợc phát triển với tác dụng ức chế enzyme neuraminidase để hạn chế việc giải phóng vi rút cúm ra khỏi tế bào nhiễm, giảm phát tán vi rút trong cơ thể. Kết quả phân tích protein NA trên 52 vi rút sử dụng trong nghiên cứu cho thấy các vi rút lƣu hành tại Việt Nam có sự thay đổi (đột biến) so với vi rút vắc xin A/California/07/09 từ 1 - 9 axit amin (bảng 3.5). Tần suất thay đổi axit amin tại các nhóm /phân nhóm trên cây gia hệ NA khác nhau, sự thay đổi N248D đƣợc xác định trên toàn bộ các vi rút nghiên cứu (100%), trong khi một số sự thay đổi khác xuất hiện với tần suất thấp hơn: V241I; N369K (71,4%) (bảng 3.6) Ngoài ra, sự đa dạng thay đổi tại một vị trí cũng đƣợc ghi nhận, ở vị trí axit amin 83 trên protein NA khi sự thay đổi V83L (nhóm 5) và V83A (phân nhóm 6C) (Bảng 3.5- 3.6). Kết quả trên cho thấy các thay đổi axit amin có tần suất thay đổi từ 42,8% đến 100% đều tại các vị trí không ảnh hƣởng đến hoạt động chức năng của neuraminidase và không gây hiện tƣợng kháng oseltamivir (Tamiflu) của vi rút cúm A/H1N1/09 đại dịch. Tuy vậy, trong nghiên cứu này, vị trí đột biến H275Y cũng đƣợc phát hiện trên 01 vi rút phân lập năm 2013. Hiện tƣợng giảm độ nhạy hoặc kháng oseltamivir của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 với đột biến tại H275Y đƣợc ghi nhận lần đầu tại Việt Nam vào tháng 7/2009 và tiếp tục xuất hiện trong một số vi rút lƣu hành vào các năm 2009-2012 [53], [68]. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi bổ sung 107 thêm dữ liệu về đột biến H275Y của vi rút A(H1N1)pdm09 trong năm 2013 dẫn đến tình trạng biến chuyển chống lại ảnh hƣởng của oseltamivir với vi rút cúm A nói chung và vi rút cúm A(H1N1)pdm09 nói riêng tại Việt Nam và thế giới. Trong nghiên cứu này, hiện trạng sử dụng oseltamivir trong điều trị cúm A(H1N1)pdm09 tại Việt Nam chƣa đƣợc đề cập, vì vậy các thông tin về các yếu tố dịch tễ liên quan, nguy cơ tiềm tàng của hiện tƣợng kháng oseltamivir trong cộng đồng là hạn chế của nghiên cứu này. Ngoài đột biến H275Y, một số đột biến khác cũng gây hiện tƣợng giảm độ nhạy hoặc kháng oseltamivir hoặc zanamivir trên protein NA là N295S; I117V; D119G; I223/K/R/V và S247N nhƣng không đƣợc phát hiện trong kết quả nghiên cứu 52 protein NA vi rút cúm A(H1N1)pdm09 của chúng tôi. Các thay đổi V241I; N369K trong nghiên cứu đƣợc xác định trên 5 nhóm/phân nhóm của cây gia hệ NA, các đột biến này cũng đƣợc báo cáo trong một nghiên cứu tại Austrailia năm 2011 và ghi nhận trên các trình tự NA trên ngân hàng gen. Để đánh giá vai trò của các đột biến tiềm tàng có khả năng đóng vai trò bù đắp lại ảnh hƣởng khi vi rút mang đột biến H275Y gây mất ổn định hoạt động chức năng của neuraminidase. Kết quả phân tích cho thấy các thay đổi V241I và N369K xuất hiện năm 2010 và hiện tại duy trì trên 80% các vi rút đang lƣu hành trên thế giới và hồi phục lại 50% độ bền vững (ổn định) của protein NA của vi rút bị mất bởi đột biến H275Y [55]. Trong nghiên cứu có đột biến axit amin tại V241I và N369K đƣợc ghi nhận trong các vi rút phân lập trong giai đoạn 2011-2013 (nhóm/phân nhóm 5; 6B; 6C; 7A; 7B) trên protein NA (hình 3.4; bảng 3.5), tuy nhiên đánh giá về độ tƣơng tác giữa V241I; N369K và H275Y trong duy trì sự ổn định chức năng của neuramindase chƣa đƣợc thực hiện trong nghiên cứu này và sẽ gợi ý cho định hƣớng cho các nghiên cứu tiếp theo trong giám sát vi rút học vi rút cúm A(H1N1)pdm09 tại Việt Nam. 108 4.5.3. Các protein M1, M2 , NS1, NS2, PB1 và PB2. Các protein M1, M2, NS1, NS2, PB1 và PB2 đƣợc dịch mã từ các trình tự nucleotide của các phân đoạn gen M, NS, PB1 và PB2 trong nghiên cứu. Tiến hành so sánh với trình tự chuỗi axit amin của vi rút vắc xin A/California/07/09 cho thấy sự tƣơng đồng về axit amin của các protein M1; M2; NS1; NS2; PB1; PB2 đạt từ 99,2% (protein NS1) đến 99,9% (protein M2). Số axit amin thay đổi đƣợc xác định nhiều nhất tại protein PB2 (7 axit amin), tiếp theo là các protein PB1 (5 axit amin), protein NS1(4 axit amin), protein M1(3 axit amin). Các protein M2 và NS2 chỉ xác định có sự thay đổi thƣờng gặp là 1 axit amin (bảng 3.7). Một số thay đổi xuất hiện với tần suất cao: I123V trên protein NS1 (100%), V344M và I354L trên protein PB2 (44,4%) trong khi các thay đổi khác đều duy trì tần suất thấp (bảng 3.8). Sự xuất hiện các thay đổi trong 6 protein mã hóa từ 3 phân đoạn gen M, NS và PB1 thƣờng liên quan đến sự tiến hóa của vi rút cúm trên vật chủ khác nhau và từ các tƣơng tác chức năng của các protein này. Protein M2 gắn liền với hoạt động thâm nhập vào tế bào chủ, lắp ráp và nảy chồi vi rút mới và đƣợc chứng mình là có thể tạo ra đáp ứng miễn dịch chéo giữa các phân týp khác nhau của vi rút cúm A, ngoài ra protein M2 cũng là đích tác động của thuốc kháng vi rút thế hệ đầu tiên – amatadine. Các đột biến trên protein này có liên quan đến kháng amatadine đƣợc ghi nhận là L26F, V27A, A30V, A30T, S31N và G34E. Vi rút cúm A(H1N1)pdm09 mang đột biến kháng amatadine S31N, ngoài ra một đột biến khác L43T liên quan đến khả năng khóa kênh vận chuyển ion tại vị trí gắn kết của rimantadine, đột biến này có nguồn gốc từ vi rút cúm lợn và đƣợc cấu trúc vào protein M2 của cúm A(H1N1)pdm09 thông qua hiện tƣợng trao đổi và tích hợp (reassortment). Hoàn toàn giống vi rút cúm vắc xin, A(H1N1)pdm09 có các đột biến kháng thuốc S31N và L43T trên protein M2 đƣợc hiện diện trên toàn bộ các vi rút nghiên cứu. Các thay 109 đổi khác trên protein M1, M2, NS1, NS2, PB1, PB2 so với vi rút vắc xin A/California/07/09 đều không ghi nhận có ảnh hƣởng đến hoạt động kích hoạt đáp ứng miễn dịch (NS1); độc lực của vi rút (PB1-F2); khả năng nhân lên và lây truyền của vi rút (PB2) (bảng 3.8). Với kết quả thu đƣợc từ phân tích protein M1, M2, NS1, NS2, PB1, PB2 của chúng tôi cho phép nhận định ảnh hƣởng của vật chủ (ngƣời) chƣa tác động nhiều đến sự tiến hóa của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 trong quá trình lƣu hành tại Việt Nam 2009-2013. 4.6. Đặc tính kháng nguyên của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Việt Nam, 2009-2013. Chúng tôi sử dụng phản ứng ngăn ngƣng kết hồng cầu (HI) và kháng huyết thanh cừu A/California/07/09 (reference anti-sheep A/California/07/09) để đánh giá đặc tính kháng nguyên của 75 chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09 trong nghiên cứu. Với kết quả có 70 chủng vi rút (chiếm 93,3%) có khả năng tƣơng tác tốt với kháng huyết thanh chuẩn có hiệu giá tƣơng đƣơng với vi rút vắc xin A/California/07/09 (HI = 640-1280) cho phép nhận định rằng chƣa có sự thay đổi đặc tính kháng nguyên trong hầu hết các vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Việt Nam trong giai đoạn 2009-2013. Nhƣ vậy, khả năng bảo vệ của vắc xin cúm mùa vẫn đảm bảo trong phòng nhiễm cúm A(H1N1)pdm09. Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu cũng ghi nhận 05 vi rút (6,7%) có khả năng tƣơng tác thấp (HI=320) với kháng huyết thanh chuẩn, kết quả đã ghi nhận sự bắt đầu thay đổi đặc tính kháng nguyên của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 tại Việt Nam và cũng phù hợp với báo cáo gần đây của TCYYTG và một số nƣớc láng giềng. Kết quả phân tích protein HA của 05 chủng vi rút có tƣơng tác thấp với kháng huyết thanh chuẩn đều cho thấy xuất hiện đột biến axit amin tại vị trí G155E, N156K, kết quả phù hợp với một số nghiên cứu của Austrailia và Singapore [10], [23]. Trên cấu trúc tinh thể protein HA, vị trí 155, 156 không nằm trong khu vực thụ cảm thể, tuy nhiên 110 thay đổi tại các vị trí này sẽ ảnh hƣởng đến khả năng kết bám, độ đặc hiệu, độ bền vững của HA với tế bào chủ, giả thuyết này đã đƣợc chứng minh qua các thử nghiệm in vitro, in vivo và phân tích qua máy tính [47]. Đặc biệt, đột biến N156K đã làm thay đổi sự đặc hiệu của thụ cảm thể, làm mất khả năng ngƣng kết hồng cầu đa dạng của vi rút cúm hoặc làm tăng tiềm năng ion hóa của protein HA, ảnh hƣởng đến sự tƣơng tác của HA với kháng thể hoặc các gốc carbonhydrate xuất phát từ cấu trúc của thụ cảm thể tế bào chủ. Với lý do đó, các vi rút cúm A(H1N1)pdm09 mang đột biến G155E, N156K sẽ có tƣơng tác kém với kháng huyết thanh chuẩn. Hình 4.1 Bản đồ đặc tính kháng nguyên của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 Nguồn: Colin Russell và Derek Smith, Đại học Cambrigde, Anh. Với tỷ lệ thấp (6,7%) các chủng vi rút có mang đột biến G155E, N156K và có biểu hiện thay đổi đặc tính kháng nguyên ghi nhận đƣợc trong nghiên cứu này và đƣợc báo cáo tại một số nƣớc trên thế giới [47], [95], tính đến thời 111 điểm hiện tại đặc tính kháng nguyên của cúm A(H1N1)pdm09 vẫn ổn định. Bản đồ đặc tính kháng nguyên của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 đƣợc phát triển bởi D.Smith trên cơ sở giá trị hiệu giá HI cũng cho thấy, phần lớn các vi rút cúm A(H1N1)pdm09 duy trì đặc tính kháng nguyên tƣơng tự vi rút vắc xin A/California/07/09 và tập trung với mật độ cao. Bên cạnh đó cũng có một nhóm có đặc tính kháng nguyên thay đổi khi hiệu giá HI < 2 bậc pha loãng so với vi rút vắc xin đều có đột biến xung quanh các vị trí từ 153 đến 157 trên protein HA (hình 3.13). Kết quả này đã nhấn mạnh sự tiến triển tƣơng đồng của vi rút A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Việt Nam và trên thế giới và tƣơng tự với các vỉ rút cúm mùa khác A/H1N1 giai đoạn trƣớc đây hoặc A/H3N2. Tuy không xác định đƣợc vị trí địa lý nhập/xuất của các vi rút cúm A(H1N1)pdm09 tại Việt Nam, nhƣng kết quả trên cùng với các kết quả phân tích gia hệ trong nghiên cứu cũng khẳng định sự khác biệt của vi rút cúm mùa và vi rút cúm gia cầm A/H5N1 khi đặc tính kháng nguyên của vi rút cúm A/H5N1 dƣờng nhƣ khác biệt giữa các vùng địa lý hoặc giữa các quốc gia. Kết quả giám sát cúm gia cầm năm A/H5N1 tại Việt Nam cho thấy clade 1 chỉ xuất hiện tại miền Nam Việt Nam và Campuchia trong khi miền Bắc Việt Nam và Trung Quốc kháng nguyên của vi rút A/H5N1 đƣợc xác định là clade 2.3.4 hoặc 2.3.2.1 hiện tại [41]. Gần đây, một số nghiên cứu trên chồn sƣơng hoặc gây nhiễm trên tế bào cảm thụ (MDCK-SIAT1) các vi rút mang đột biến N156K kết quả cho thấy đột biến này đƣợc duy trì và lan truyền trong các thế hệ sau, gợi ý khả năng thay đổi đặc tính kháng nguyên của vi rút, giảm hiệu quả bảo vệ vắc xin với vi rút cúm A(H1N1)pdm09 sẽ xảy ra trong tƣơng lai [47]. Ngoài ra, trong quá trình cấy chuyển trên động vật hoặc tế bào dƣới áp lực của đáp ứng miễn dịch lựa chọn, cũng cho thấy vi rút A(H1N1)pdm09 mang N156K thế hệ mới sẽ rất dễ đƣợc bổ sung thêm các đột biến khác xung quanh (N156K với G155E 112 hoặc N156K với K153E); hoặc tại khu vực đầu hình cầu của protein HA [95]. Trong nghiên cứu của chúng tôi, toàn bộ 05 vi rút cúm A(H1N1)pdm09 mang đột biến N156K đều đi kèm đột biến G155E (hình 3.11) và phù hợp với kết quả HI với hiệu giá HI thấp hơn so với vi rút vắc xin A/California/07/09 (bảng 3.9). Tiếp tục phân tích các vi rút mang đột biến sẽ bổ sung thêm các thông tin để có thể định hƣớng vắc xin trong tƣơng lai và đề xuất các vi rút dự tuyển vắc xin phù hợp cho thành phần vắc xin cúm mùa hàng năm. 4.7. Kết quả thử nghiệm ức chế neuraminidase (NAI). Chúng tôi tiến hành đánh giá khả năng tƣơng tác của oseltamivir với vi rút cúm A(H1N1)pdm09 mang đột biến H275Y (A/Vietnam/IS0213167/2013) đƣợc phát hiện trên phân đoạn gen NA trong nghiên cứu. Sử dụng kết quả của Trung tâm cúm Quốc gia – Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng về thử nghiệm ức chế neuraminidase (NAI) ức chế 50% số vi rút cúm bằng oseltamivir cho phép đánh giá khả năng tƣơng tác của vi rút với thuốc kháng vi rút. Thử nghiệm đƣợc thực hiện với các vi rút chứng (có hoặc không có đột biến H275Y), kết quả cho thấy: vi rút mang đột biến H275Y trong nghiên cứu yêu cầu một lƣợng oseltamivir cao hơn 250 lần so với vi rút chứng (không mang H257Y) để ức chế đƣợc 50% hoạt động của oseltamivir. Nhƣ vậy vi rút này đƣợc đánh giá theo TCYTTG là giảm mạnh khả năng tƣơng tác với oseltamivir hoặc có biểu hiện kháng oseltamivir (giảm hiệu quả ức chế vi rút >100 lần) (Bảng 3.12). Giá trị độ nhạy với oseltamivir của vi rút trong nghiên cứu đƣợc xác định là giảm 250 lần, tuy nhiên một số nghiên cứu giai đoạn trƣớc tại Việt Nam đã phát hiện các vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Việt Nam có mang H275Y có giá trị giảm độ nhạy dao động từ 356 đến 2944 lần so với giá trị ngƣỡng [53], [68]. Nhƣ vậy tuy cùng xuất hiện đột biến đặc hiệu kháng 113 oseltamivir (H275Y) nhƣng biểu hiện giảm độ nhạy của các vi rút khác nhau. Biểu hiện sinh học (kiểu hình) là kết quả của cấu trúc di truyền (kiểu gen) và thƣờng bị ảnh hƣởng của nhiều yếu tố khác nhau (môi trƣờng, vật chủ...) sẽ tạo ra sự đa dạng sinh học trong tự nhiên. Nghiên cứu năm 2010 tại Pháp, về hiện tƣợng kháng oseltamivir của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 mang đột biến đặc hiệu H275Y cho thấy: mức độ kháng oseltamivir sẽ tăng nếu vi rút có thêm đột biến I223R (giảm độ nhạy 6195 lần) và vi rút mang H275Y và I223R cũng sẽ kháng cả zanamivir (giảm độ nhạy 16,5 lần) ở mức độ cao [71]. Ngoài ra, đột biến kép H275Y và S247N cũng làm tăng biểu hiện kháng oseltamivir (giảm độ nhạy 5880 lần) và zanamivir (giảm độ nhạy 5 lần) cũng đƣợc phát hiện tại Austrailia và Singapore, 2009-2010 [56]. Trong nghiên cứu này của chúng tôi, vi rút A(H1N1)pdm09 chỉ mang đột biến duy nhất H275Y liên quan đến kháng oseltamivir, vì vậy mức độ biểu hiện giảm độ nhạy với oseltamivir là 250 lần là phù hợp. Sử dụng oseltamivir nhƣ thuốc đặc trị cho nhiễm vi rút cúm A, đặc biệt là nhiễm cúm A/H5N1 tại Việt Nam đang đƣợc phổ biến rộng rãi, vì vậy khả năng tăng và lan rộng các vi rút có biểu hiện kháng thuốc là có thể trong tƣơng lai. Để kiểm soát đƣợc tình trạng kháng oseltamivir của vi rút cúm việc duy trì, tăng cƣờng giám sát vi rút học sự lƣu hành vi rút cúm tại Việt Nam, đồng thời nâng cao khả năng phát hiện hiện tƣợng kháng thuốc và xây dựng phác đồ điều trị phối hợp thuốc hợp lý sẽ là các phƣơng pháp tích cực cần đƣợc quan tâm. 4.8. Lựa chọn chủng vắc xin dự tuyển cho phát triển vắc xin phòng cúm A(H1N1)pdm09 tại Việt Nam. Vắc xin đƣợc xác định là công cụ hiệu quả nhất trong phòng chống nhiễm vi rút cúm và đƣợc sử dụng rộng rãi trên thế giới từ những năm 1960. Hiện tại, vắc xin cúm lƣu hành thƣơng mại có thành phần gồm 3 loại vi rút 114 (A/H1N1pdm; A/H3N2 và B-Victoria hoặc B -Yamagata) hoặc 4 loại vi rút (A/H1N1pdm; A/H3N2, B-Victoria và B-Yamagata), các vi rút thành phần của vắc xin đƣợc lựa chọn hàng năm thông qua hệ thống giám sát cúm toàn cầu của TCYTTG. Tại Việt Nam, vắc xin cúm đã đƣợc thử nghiệm phát triển tại một số công ty nhƣ: VABIOTECH (vắc xin cúm A/H5N1 hoặc A(H1N1)pdm09), IVAC (vắc xin cúm A(H1N1)pdm09), POLYVAC.... Với các công nghệ phát triển khác nhau: tế bào thận khỉ tiên phát (VABIOTECH), tế bào MDCK (POLIVAC) hoặc trứng gà có phôi (IVAC), nhƣng đều sử dụng các vi rút vắc xin từ TCYTTG là A/California/07/09. Tuy nhiên, sự lƣu hành của vi rút cúm khác nhau về thời gian, phân týp vi rút cũng nhƣ sự nổi trội của các phân týp khác nhau.... Chính vì vậy, việc tự lựa chọn cho mình vi rút dự tuyển vắc xin và sản xuất vắc xin cúm từ vi rút dự tuyển đó là chiến lƣợc phòng bệnh của một số nƣớc : Hàn Quốc, Nhật Bản, Trung Quốc, Cuba, Nga.... Việc sử dụng vắc xin trong nƣớc sản xuất, sử dụng vi rút lựa chọn từ giám sát vi rút học trong nƣớc sẽ giúp cho hiệu quả phòng bệnh sẽ cao vì phù hợp về thời gian (mùa), tƣơng đồng cao về đặc tính kháng nguyên đảm bảo khả năng đáp ứng miễn dịch tốt. Để góp phần vào việc phát triển một vắc xin phòng chống cúm A(H1N1)pdm09 có hiệu quả tại Việt Nam, kết quả nghiên cứu của chúng tôi đã giới thiệu 02 vi rút có khả năng sử dụng để phát triển vắc xin: A/Vietnam/HN36947 và A/Vietnam/NH13284. Hai vi rút này đƣợc lựa chọn theo tiêu chí của TCYTTG áp dụng vào điều kiện Việt Nam là :  Đại diện cho đa phần các chủng lƣu hành tại Việt Nam về di truyền cũng nhƣ đặc tính kháng nguyên.  Có khả năng khuếch đại tốt trên các hệ thống nuôi (tế bào hoặc trứng).  Có tính ổn định về di truyền và đặc tính kháng nguyên. 115 Trong lựa chọn vi rút dự tuyển vắc xin với mục đích đảm bảo tốt nhất khả năng tạo miễn dịch trong quần thể (là vi rút đại diện cho phần lớn các vi rút đang lƣu hành), tạo điều kiện thuận lợi cho các đơn vị sản xuất vắc xin có thể giảm giá thành (do có khả năng khuếch đại tốt), thuận lợi trong quá trình đánh giá chất lƣợng vắc xin (tính ổn định về di truyền và đặc tính kháng nguyên). Hai vi rút đƣợc lựa chọn trong nghiên cứu đều ở phân nhóm 6C của cây gia hệ HA hoặc 6A hoặc 6B của cây gia hệ NA, đây là nhóm tập trung 32% (24/75 vi rút - cây HA) của toàn bộ nghiên cứu và đƣợc phân lập trong năm gần nhất của nghiên cứu 2013 (hình 3.2, hình 3.4; bảng 3.13). Nhƣ vậy các vi rút đƣợc lựa chọn đảm bảo là vi rút thế hệ mới nhất (phân lập năm 2013) và đảm bảo cho sự tiến triển (tiến hóa) cao về di truyền, vì vậy sẽ có biểu hiện kháng nguyên mới nhất, cập nhật nhất trong thời điểm hiện tại trong quần thể vi rút lƣu hành tại Việt Nam. Kết quả đánh giá khả năng khuếch đại của vi rút cũng cho thấy, 2 vi rút dự tuyển vắc xin đều có khả năng nhân lên và đạt hiệu giá ngƣng kết hồng cầu (HA) cao và ổn định sau 5 lần cấy truyền (bảng 3.14). Trong nghiên cứu chúng tôi sử dụng tế bào MDCK và thực hiện 5 lần cấy chuyển với mục đích hạn chế các thay đổi (đột biến) trong quá trình nhân lên của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 và đảm bảo có hiệu giá khuếch đại tốt nhất. Mỗi loại vi rút cúm có hệ thống nuôi cảm nhiễm khác nhau, các nghiên cứu cho thấy vi rút cúm A(H1N1)pdm09 dễ dàng nhân lên và khuếch đại trên tế bào có nguồn gốc động vật (MDCK, Vero), trong khi vi rút cúm A/H3N2 lại ghi nhận có hiệu quả tốt khi sử dụng trứng gà có phôi [88]. Ngoài ra nghiên cứu tại Nga cho thấy không có sự khác biệt về hiệu quả nhân lên và khuếch đại vi rút cúm A(H1N1)pdm09 trên tế bào MDCK và NHBE (hum