Phân lập và nhận diện một số dòng vi khuẩn khử đạm (Denitrifying bacteria) từ chất thải trại chăn nuôi

Kỷ yếu Hội nghị khoa học 123 PHÂN LẬP VÀ NHẬN DIỆN MỘT SỐ DÒNG VI KHUẨN KHỬ ĐẠM (DENITRIFYING BACTERIA) TỪ CHẤT THẢI TRẠI CHĂN NUÔI Nguyễn Thành Nhân* Trường Đại học Tiền Giang *Tác giả liên hệ: nguyenthanhnhan@tgu.edu.vn TÓM TẮT 30 dòng vi khuẩn khử đạm được phân lập từ chất thải trại chăn nuôi heo ở 2 huyện Châu Thành và Chợ Gạo, tỉnh Tiền Giang và xác định được 21 dòng vi khuẩn trong tổng số 30 dòng vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR 16S-rDNA với cặp mồi tổng và xác định 17 dòng/21 dòng là vi khuẩn Pseudomonas stutzeri với cặp mồi đặc hiệu. Tiến hành giải trình tự 3 dòng vi khuẩn trong 17 dòng vi khuẩn và so sánh với ngân hàng dữ liệu bằng phần mềm BLASTN cho thấy cả 3 dòng vi khuẩn có mức độ đồng hình 99% với vi khuẩn Pseudomonas stutzeri chuẩn từ đó có thể phát triển thành chế phẩm sinh học xử lý môi trường. Từ khóa: Chất thải trại chăn nuôi heo, vi khuẩn khử đạm, PCR, giải trình tự, Pseudomonas stutzeri. DETERMINATION AND IDENTIFICATION OF A NUMBER OF (DENITRIFYING BACTERIA) FROM FARMING WASTE Nguyen Thanh Nhan* Tien Giang University *Corresponding Author: nguyenthanhnhan@tgu.edu.vn ABSTRACT Thirty denitrifying bacteria isolates were isolated from piggery farms wastes in Chau Thanh and Cho Gao district, Tien Giang province. Among 30 isolates, 21 isolates were identified with PCR 16S-rDNA technique with universal primers, and 17/21 isolates as Pseudomonas stutzeri with specific primers. 3/17 isolates were sequenced and compared with genebank data by BLAST N software, the result showed that three isolates have 99% homology with standard Pseudomonas stutzeri. Keywords: Piggery wastes, denitrifying bacteria, PCR, sequencing, Pseudomonas stutzeri. TỔNG QUAN Tốc độ công nghiệp hóa và đô thị hóa khá nhanh cùng với sự gia tăng dân số gây áp lực ngày càng nặng nề đối với tài nguyên nước trong vùng lãnh thổ. Môi trường nước ở nhiều đô thị, khu công nghiệp và làng nghề ngày càng bị ô nhiễm bởi nước thải, khí thải và chất thải rắn, các chỉ số BOD5, oxy hoà tan, các chất ammonium, nitrite, nitrate đang ở mức báo động. Trong đó sự ô nhiễm nitrate là một ưu tư rất lớn. Nitrate trong nguồn nước là một nguy cơ ảnh hưởng đến sức khoẻ của con người và thú vật, nhất là trẻ con dưới sáu tháng, là mối nguy lớn cho ngành chăn nuôi thủy sản. Nhiều nghiên cứu cho thấy một số dòng vi khuẩn tham gia trong chu trình nitơ (đặc biệt là những vi khuẩn có mang gen mã hóa enzyme nitrite reductase- nirK & nirS và enzyme nitrous oxide reductase-nosZ) có khả năng khử đạm trong nước thải hoặc phân súc vật, giúp giảm lượng nitrate, ammonium gây mùi hôi và làm ô nhiễm nguồn nước.Vì vậy việc nghiên cứu phân lập và nhận diện một số dòng vi khuẩn khử đạm (denitrifying bacteria) từ chất thải ở trại chăn nuôi bằng kỹ thuật PCR nhằm ứng dụng các dòng vi khuẩn này trong xử lý chất thải ở trại chăn nuôi. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Phương tiện và mẫu nghiên cứu Cân điện tử, tủ cấy vi sinh vật, tủ ủ vi sinh vật, tủ lạnh giữ mẫu, ống tube dùng để chạy PCR, đĩa petri, ống nghiệm, que cấy, que thủy tinh, bình tam giác, lam, lamen, bịch nylon và chai đựng mẫu bùn và mẫu nước... Mẫu chất thải rắn và lỏng thu từ các trại chăn nuôi heo ở huyện Chợ Gạo và Châu Thành, tỉnh Tiền Giang. Kỷ yếu Hội nghị khoa học 124 Phương pháp nghiên cứu Phân lập vi khuẩn Pseudomonas stutzeri Nhận diện vi khuẩn Pseudomonas stutzeri bằng phương pháp PCR. Kiểm tra khả năng khử Nitrate, Nitrite và oxid hóa Ammonium của các dòng vi khuẩn Pseudomonas stutzeri. Giải trình tự DNA của vi khuẩn Pseudomonas stutzeri. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Bảng 1. Đặc điểm hình thái của các dòng vi khuẩn phân lập STT Dòng vi khuẩn Đặc điểm vi khuẩn Đặc điểm khuẩn lạc Hình dạng Chuyển động Màu sắc Hình dạng Dạng bìa Độ nổi Kích thước (mm) 1 1RA Que ngắn ++ Trắng sữa Tròn Bìa nguyên Mô 0,6 2 1RB Que ngắn ++ Trắng đục Tròn Bìa nguyên Mô 1 3 1RC Que ngắn ++ Vàng nhạt Tròn Bìa nguyên Mô 0,2 4 2RB Que ngắn ++ Vàng nhạt Tròn Bìa nguyên Mô 0,6 5 2NA Que ngắn + Vàng Tròn Bìa nguyên Mô 0,6 6 3NA Que ngắn ++ Trắng, tròn Tròn Bìa nguyên Mô 0,4 7 3NC Que ngắn ++ Vàng nhạt Tròn Bìa nguyên Mô 0,4 8 4RA Que ngắn ++ Trắng đục Tròn Bìa nguyên Mô 0,8 9 4RB Que ngắn ++ Trắng đục Tròn Bìa nguyên Mô 0,6 10 4RC Que ngắn ++ Trắng đục Tròn Bìa nguyên Mô 0,6 11 5RA Que ngắn ++ Trắng đục Không đều Bìa răng cưa Mô 1 12 5NA Que ngắn ++ Trắng đục Tròn Bìa nguyên Mô 1 13 6NB Que ngắn ++ Vàng nhạt Tròn Bìa nguyên Mô 0,4 14 6RC Que ngắn ++ Vàng nhạt Không đều Bìa răng cưa Lài 0,8 15 7RA Que ngắn ++ Trắng đục Tròn Bìa nguyên Lài 0,8 16 7RC Que ngắn ++ Trắng đục Tròn Bìa nguyên Mô 0,6 17 7RD Que ngắn ++ Trắng sữa Tròn Bìa nguyên Mô 0,6 18 7RE Que ngắn ++ Trắng đục Tròn Bìa nguyên Mô 0,6 19 8NA Que ngắn ++ Trắng đục Tròn Bìa răng cưa Lài 0,8 20 8NB Que ngắn ++ Trắng đục Tròn Bìa nguyên Mô 0,8 Kỷ yếu Hội nghị khoa học 125 21 9RA Que ngắn ++ Vàng nhạt Tròn Bìa nguyên Mô 0,4 22 9NB Que ngắn ++ Trắng đục Tròn Bìa răng cưa Lài 0,8 23 9NC Que ngắn ++ Trắng đục Tròn Bìa nguyên Mô 1 24 10RA Que ngắn ++ Vàng Tròn Bìa nguyên Mô 0,8 25 10RB Que ngắn + Trắng sữa Tròn Bìa nguyên Mô 0,8 26 10RD Que ngắn ++ Vàng nhạt Tròn Bìa nguyên Mô 0,8 27 10NA Que ngắn ++ Trắng đục Tròn Bìa nguyên Lài 0,8 28 10NB Que ngắn + Trắng đục Tròn Bìa nguyên Mô 0,8 29 10NC Que ngắn ++ Trắng sữa Tròn Bìa nguyên Mô 0,8 30 10ND Que ngắn ++ Trắng sữa Tròn Bìa nguyên Mô 0,8 Ghi chú: (+): Vi khuẩn chuyển động chậm; (++): Vi khuẩn chuyển động nhanh Từ 30 dòng vi khuẩn đã phân lập tiến hành quan sát đặc điểm, hình thái khuẩn lạc với kết quả là hầu hết các khuẩn lạc màu trắng đục, trắng sữa hay vàng, bề mặt khuẩn lạc mô trơn, một số có dạng lài, bìa nguyên hay răng cưa, kích thước khoảng 0,2÷1mm. Về đặc điểm của vi khuẩn cho thấy tất cả các dòng vi khuẩn đều có dạng que ngắn và có khả năng chuyển động trong môi trường lỏng nhờ tế bào có chiên mao.Trong đó vi khuẩn chuyển động nhanh chiếm đa số với 27/30 dòng, chiếm tỷ lệ 90%, vi khuẩn chuyển động chậm có 3/30 dòng, chiếm tỷ lệ 10%. Kết quả này phù hợp với mô tả của Han-Woong Lee et al.(2002) và Lalucat et al., (2006). Về đặc điểm của khuẩn lạc thì trong tổng số 30 dòng vi khuẩn phân lập được có 21/30 dòng vi khuẩn có màu trắng sữa hay trắng đục chiếm tỷ lệ 70% và có 9/30 dòng có màu vàng hay vàng nhạt chiếm tỷ lệ 30% Về hình dạng bìa của khuẩn lạc: Kết quả phân lập cho thấy có 26/30 dòng vi khuẩn có dạng bìa nguyên chiếm tỷ lệ 86,67% và có 4/30 dòng vi khuẩn có dạng bìa răng cưa chiếm tỷ lệ 13,33% Chọn dòng 2 vi khuẩn chụp hình dưới kính hiển vi điện tử quét ta nhận thấy vi khuẩn có dạng hình que và có chiên mao ở đỉnh. Kết quả này phù hợp với mô tả của Lalucat et al., (2006). Nhận diện vi khuẩn Pseudomonas stutzeri bằng kỹ thuật PCR Khi phân tích PCR với cặp primer tổng 16f27; 16r1488 để nhận diện các dòng vi khuẩn là Pseudomonas (Hình 1). Kết quả nhận thấy có 21/30 dòng vi khuẩn phân lập được có band ở vị trí 1500bp là những dòng Pseudomonas phù hợp với band của vi khuẩn đối chứng dương Pseudomonas stutzeri ATTC 14405. 21 dòng Pseudomonas là: 1RB, 1RC, 2NA, 2RB, 3NA, 3NC, 4RC, 5NA, 5RA, 6NB, 6RC, 7RA, 7RC, 7RD, 7RE, 9RA, 9NB, 8NB, 10RD, 10NA, 10NB. Hình 1. Phổ điện di DNA của các dòng vi khuẩn Pseudomonas Kỷ yếu Hội nghị khoa học 126 Chú thích: 1: Thang chuẩn 100bp plus 2: ATCC 14405 20: 5N 4: 3NC 22: 6RC 6: 4RC 23: 6NB 7: 2RB 24: 7RE 9: 1RB 25: 7RD 10: 7RA 26: 2NA 11: 1RC 27: 9RA 12: 7RC 29: 9NB 15: 3NA 30: 8NB 19: 5RA 31: 10RD 32: 10NA 33: 10ND Tiếp tục kiểm tra sản phẩm PCR đã được khuyếch đại với cặp mồi đặc hiệu fps158; rps743 của 21 dòng vi khuẩn Pseudomonas trên gel argarose 1,2% (Hình 2). Hình 2. Phổ điện di DNA của các dòng vi khuẩn Pseudomonas stutzeri Chú thích: 1: Thang chuẩn 100bp 2: ATCC14405 15: 2NA 3: 6NB 16: 3NA 4: 2RB 17: 3NC 6: 7RA 18: 4RC 8: 5NA 19: 6RC 10: 1RB 20: 1RC 11: 10ND 21: 7RE 13: 8NB 22: 7RD 14: 10NA 23: 5RA Kiểm tra khả năng khử Nitrate, Nitrite và oxid hóa Ammonium của các dòng vi khuẩn Pseudomonas stutzeri Kết quả kiểm tra cho thấy 17/17 dòng vi khuẩn Pseudomonas stutzeri phân lập được đều có khả năng oxid hóa ammonium, chiếm tỷ lệ 100%. Trong đó có 6 dòng là: 6RC, 7RA, 7RD, 10ND, 10NA, 8NB là có khả năng oxid hóa ammonium mạnh, 6 dòng gồm: 4RC, 1RB, 5NA, 5RA, 6NB, 2NA có khả năng oxid hóa ammonium trung bình, còn lại 5 dòng là: 3NC, 1RC, 2RB, 7RE, 3NA có khả năng oxid hóa ammonium yếu (Bảng 2). Bảng 2. Kết quả kiểm tra sự phát triển của các dòng vi khuẩn trên 3 môi trường STT Môi trường Nitrate Ammonium Nitrite Dòng Ngày 1 Ngày 2 Ngày 1 Ngày 2 Ngày 1 Ngày 2 1 3NC + + + + + ++ 2 4RC ++ ++ ++ ++ − − 3 1RC − + + + − + 4 1RB ++ ++ ++ ++ + + 5 2RB − + + + − + 6 5NA + ++ + ++ − − 7 5RA ++ ++ ++ ++ ++ ++ 8 6NB − + + ++ + + 9 6RC +++ +++ +++ +++ ++ +++ 10 7RA + ++ +++ +++ + ++ 11 7RD + ++ + +++ + ++ 12 7RE + + + + + ++ 13 10ND + + +++ +++ + + 14 2NA + + + ++ − + 15 3NA − + + + − + 16 10NA + ++ ++ +++ + ++ 17 8NB + + ++ +++ − − Chú thích: ( - ): không phát triển; ( +): phát triển yếu ( ++): phát triển trung bình; (+++): phát triển mạnh Kỷ yếu Hội nghị khoa học 127 Tiến hành đo nồng độ DNA của 3 dòng vi khuẩn 6RC, 7RA và 10NA với kết quả nồng độ DNA rất tốt (Bảng 3). Bảng 3. Kết quả nồng độ DNA các dòng vi khuẩn giải trình tự STT Tên dòng Độ hấp thụ 260nm Độ hấp thụ 280nm 260nm/280nm 1 6RC 0,1518 0,0823 1,8445 2 7RA 0,1353 0,0735 1,8408 3 10NA 0,1485 0,0785 1,8917 Kết quả giải trình tự trên máy ABI 3130 của các dòng vi khuẩn 6RC, 7RA và 10NA được trình bày ở bảng 6, 8, 10 và chúng tôi sử dụng phần mềm BLASTN để so sánh trình tự của các dòng vi khuẩn trên với trình tự của vi khuẩn trong ngân hàng gen (EMBL Nucleotide Sequence database) cho thấy cả 3 dòng 6RC, 7RA và 10NA đều có mức độ đồng hình với dòng Pseudomonas stutzeri CCUG 11256 là 99%. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Phân lập được 30 dòng vi khuẩn từ 2 nhóm mẫu chất thải rắn và lỏng thu từ các trại chăn nuôi heo ở 2 huyện Châu Thành và Chợ Gạo, tỉnh Tiền Giang. Các dòng vi khuẩn này có đặc điểm như: hình que, màu trắng đục, trắng sữa hay màu vàng, bề mặt khuẩn lạc mô trơn hay có dạng lài. Phân tích PCR với cặp mồi tổng đã nhận diện được 21/30 dòng vi khuẩn là Pseudomonas trong đó có 17 dòng là Pseudomonas stutzeri khi phân tích với cặp mồi đặc hiệu. Các dòng vi khuẩn Pseudomonas stutzeri đều có khả năng khử đạm, chọn 3 dòng 6RC, 7RA và 10NA để tiến hành giải trình tự. Kết quả, cả 3 dòng có mức độ đồng hình với vi khuẩn Pseudomonas stutzeri CCUG 11256 chuẩn là 99%. Đối với các dòng vi khuẩn đã nhận diện cần phải tiếp tục kiểm tra khả năng khử đạm, thí nghiệm xử lý các nguồn ô nhiễm amonium. Đặc biệt xử lý ô nhiểm chất thải ở các trại chăn nuôi heo. Tiếp tục phân lập và nhận diện các dòng vi khuẩn Pseudomonas stutzeri có khả năng khử đạm hiệu quả hơn, phát triển thành chế phẩm sinh học xử lý môi trường. TÀI LIỆU THAM KHẢO Cao Ngọc Điệp ,Nguyễn Hữu Hiệp, (2002), Giáo trình vi sinh vật chuyên sâu. Viện nghiên cứu và phát triển công nghệ sinh học, Trường Đại học Cần Thơ. Dương Tấn Lộc. (2006). Để thị trường cá tra bền vững. Tạp chí khoa học Cần Thơ.16 (2): tr.20 - 23. Hồ Huỳnh Thùy Dương. (2002). Sinh học phân tử (tái bản lần 2). NXB Giáo dục.Chương 14. Nguyễn Đức Lượng. Công nghệ vi sinh vật. tập 1. Cơ sở vi sinh vật công nghiệp.NXB Đại quốc gia TPHCM. Nguyễn Văn Cách.(2005). Tin sinh học. NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội. Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu. (2005). Sinh học phân tử giới thiệu phương pháp và ứng dụng. NXB Nông Nghiệp TPHCM. Nguyễn Trần Hải Bằng.(2008), Nhận diện gen nosZ, cd1- nir của vi khuẩn Pseudomonas stutzeri, Luận văn tốt nghiệp Đại học chuyên ngành công nghệ sinh học. Baggi, G., P. Barbieri, E. Galli, and S. Tollari (1987), “Isolation of a Pseudomonas stutzeri strain that degrades oxylene”, Appl. Environ.Microbiol., 53(9),pp.2129- 3132. Bennasar, A., R. Rosselló- Mora, J. Lalucat and E. R. B. Moore (1996), “16S rRNA gene sequence analyses relative to genomovars of Pseudomonas stutzeri and proposal of Pseudomonas balearica sp.nov”, Int. J. Syst. Bacteriol., 46(1), pp. 200 – 205.