Phương pháp phân tích một số chỉ tiêu vi sinh cơ bản của thực phẩm

Lê Minh Tâm - 2007 55 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH MỘT SỐ CHỈ TIÊU VI SINH CƠ BẢN CỦA THỰC PHẨM 1. ĐỊNH LƯỢNG VSV BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM SỐ KHUẨN LẠC TRÊN MÔI TRƯỜNG ĐẶC - Đối với vsv đơn bào, ta có thể xem mỗi khuẩn lạc là kết quả của sự phát triển từ một tế bào ban đầu - Ưu điểm: định lượng được tế bào sống - Nhược điểm: tốn nhiều thời gian, nhân lực Pha loãng: tiến hành pha loãng mẫu với các độ pha loãng khác nhau: 10-1, 10-2, 10-3 ... Lê Minh Tâm - 2007 56 Tính kết quả: v Chú ý: chọn tất cả các hộp petri có số khuẩn lạc dao động trong khoảng 25-250. Trường hợp 1: chỉ có 1 hộp petri có số khuẩn lạc dao động trong khoảng 25-250 (tất cả các hộp petri còn lại có số khuẩn lạc dao động nằm ngoài khoảng trên) Công thức tính: Trong đó: N – số khuẩn lạc có trong 1mL mẫu huyền phù ban đầu C1,C2 – số khuẩn lạc đếm được trên 2 hộp petri ở độ pha loãng đã chọn d – hệ số pha loãng mẫu Ví dụ: tính số khuẩn lạc có trong 1mL mẫu ban đầu, biết số liệu thí nghiệm như sau: 1 2 2 C CN d + = Lê Minh Tâm - 2007 57 Hệ số pha loãng Số khuẩn lạc đếm được Hộp petri 1 Hộp petri 2 10-1 40 20 10-2 6 3 Đáp số: 3.102 khuẩn lạc/mL Trường hợp 2: chỉ có 1 độ pha loãng với 2 hộp petri có số khuẩn lạc dao động từ 25-250 (tất cả các hộp petri khác có số khuẩn lạc nằm ngoài khoảng trên) Công thức tính: tương tự như trên Ví dụ: tính số khuẩn lạc có trong 1mL mẫu ban đầu, biết số liệu thí nghiệm như sau: Đáp số: ~1,4.106 khuẩn lạc/mL Trường hợp 3: ở hai độ pha loãng liên tiếp, các hộp petri có số khuẩn lạc dao động từ 25-250. Khi đó, ta phải tính kết quả cho từng độ pha loãng. 3.1 Nếu kết quả thu được ở 2 độ pha loãng liên tiếp chênh lệch nhau 2 lần hoặc nhỏ hơn, ta tính như sau: Hệ số pha loãng Số khuẩn lạc đếm được Hộp petri 1 Hộp petri 2 10-3 > 250 > 250 10-4 150 120 10-5 15 10 Lê Minh Tâm - 2007 58 khuẩn lạc/mL khuẩn lạc/mL khuẩn lạc/mL 1 2( 0,1. ) C N n n d = + å Trong đó: N – số khuẩn lạc có trong 1mL mẫu huyền phù ban đầu C – số khuẩn lạc đếm được trên các hộp petri đã chọn n1,n2 – số hộp petri ở hai độ pha loãng liên tiếp đã chọn d – hệ số pha loãng mẫu Ví dụ: - Ở độ pha loãng 10-2, số khuẩn lạc đếm được trên 2 hộp petri là 151 và 215. Suy ra, số khuẩn lạc trong 1mL mẫu ban đầu là: 4 2 151 215 1,8.10 2.10- + = - Ở độ pha loãng 10-3, số khuẩn lạc đếm được trên 2 hộp petri là 25 và 31. Suy ra, số khuẩn lạc trong 1mL mẫu ban đầu là: 4 3 25 31 2,8.10 2.10- + = - Vì chênh lệch giữa 1,8.104 và 2,8.104 không lớn hơn hai lần, nên kết quả cuối cùng như sau: 4 2 151 215 25 31 1,9.10 (2 0,1.2).10 N - + + + = = + Lê Minh Tâm - 2007 59 khuẩn lạc/mL khuẩn lạc/mL 3.2 Nếu kết quả thu được ở 2 độ pha loãng liên tiếp chênh lệch nhau lớn hơn 2 lần: sử dụng độ pha loãng nhỏ hơn để tính kết quả: Ví dụ: - Ở độ pha loãng 10-2, số khuẩn lạc đếm được trên 2 hộp petri là 180 và 250. Suy ra, số khuẩn lạc trong 1mL mẫu ban đầu là: 4 2 180 250 2, 2.10 2.10- + = - Ở độ pha loãng 10-3, số khuẩn lạc đếm được trên 2 hộp petri là 60 và 75. Suy ra, số khuẩn lạc trong 1mL mẫu ban đầu là: 4 3 60 75 6,8.10 2.10- + = Vì chênh lệch giữa 2,2.104 và 6,8.104 lớn hơn 2 lần, nên ta sẽ sử dụng độ pha loãng nhỏ hơn 10-2 để tính kết quả. Số khuẩn lạc có trong 1mL mẫu ban đầu sẽ là 2,2.104 Trường hợp 4: tất cả các hộp petri đều có số khuẩn lạc nhỏ hơn 25. Khi đó, ta sẽ chọn hệ số pha loãng thấp nhất để tính kết quả: Ví dụ: kết quả thí nghiệm thu được như sau: Lê Minh Tâm - 2007 60 khuẩn lạc/mL khuẩn lạc/mL Hệ số pha loãng Số khuẩn lạc đếm được Hộp petri 1 Hộp petri 2 10-1 20 15 10-2 3 2 Chọn hệ số pha loãng thấp nhất là 10-1. Số khuẩn lạc có trong 1mL mẫu ban đầu là: 2 1 20 15 1,8.10 2.10 N -- + = ; Trường hợp 5: tất cả các hộp petri đều có số khuẩn lạc lớn hơn 250. Khi đó, ta sẽ chọn hệ số pha loãng cao nhất để tính kết quả: Hệ số pha loãng Số khuẩn lạc đếm được Hộp petri 1 Hộp petri 2 10-4 2550 2800 10-5 260 300 Chọn hệ số pha loãng thấp nhất là 10-5. Số khuẩn lạc có trong 1mL mẫu ban đầu là: 7 5 260 300 2,8.10 2.10 N - + = = Trường hợp 6: không có khuẩn lạc nào mọc trên tất cả các hộp petri. Khi đó, ta sẽ ghi kết quả là có ít hơn (1x 1 d ) khuẩn lạc. Trong đó, d là hệ số pha loãng thấp nhất. Lê Minh Tâm - 2007 61 Ví dụ: hệ số pha loãng mẫu lần lượt là 10-3, 10-5 và 10-7. Sau khi nuôi cấy không thấy có khuẩn lạc nào phát triển trên tất cả các hộp petri. Ta ghi kết quả như sau: < 1.10-3 khuẩn lạc trong 1mL mẫu ban đầu. 2. TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ TRONG TP - Đánh giá khái quát về tình trạng vệ sinh của thực phẩm, dự đoán thời gian bảo quản của sản phẩm. - Tổng số VK hiếu khí cho phép có mặt trong sản phẩm có thể thay đổi, cao nhất là 5.104 khuẩn lạc/g sản phẩm. - Sử dụng môi trường thạch tryptone glucose: Tryptone : 5g Chất chiết nấm men : 2,5g Glucose : 1g Thạch : 15-20g Nước cất (định mức) : 1L pH cuối : 7,0 ± 0,2 Tiệt trùng môi trường ở 1210C trong thời gian 15 phút - Cách thực hiện: · Chuẩn bị mẫu: lấy 25g mẫu rồi cho vào bình xay vô khuẩn. Cho tiếp vào bình xay 225mL nước peptone và xay nhuyễn mẫu. Ta sẽ thu được dd huyền phù có độ pha Lê Minh Tâm - 2007 62 loãng là 10-1. Sử dụng nước peptone để tiếp tục pha loãng mẫu với các hệ số pha loãng là 10-2, 10-3 · Cấy mẫu: mẫu thực phẩm được nuôi cấy với ba độ pha loãng khác nhau, sử dụng 2 hộp petri cho mỗi độ pha loãng. · Nuôi cấy: mẫu được giữ trong điều kiện hiếu khí ở nhiệt độ 300C-350C trong thời gian từ 48-72g. - Tính kết quả: tương tự như phương pháp định lượng vi sinh vật trên môi trường đặc. 3. TỔNG SỐ NẤM MEN VÀ NẤM SỢI TRONG TP - Tiến hành tương tự như phương pháp xác định tổng vi khuẩn hiếu khí trong thực phẩm. - Sử dụng môi trường thách nấm men và nấm sợi (Yeast and mould agar). Thành phần như sau: Chất chiết nấm men : 3g Chất chiết malt : 3g Peptone : 5g Dextrose : 10g Thạch : 20g Nước cất : 1L pH cuối : 6,2 ± 0,2 Tiệt trùng môi trường ở 1210C trong thời gian 15 phút Lê Minh Tâm - 2007 63 4. SỐ BÀO TỬ TRONG GIA VỊ THỰC PHẨM - Có 2 giống bào tử thường gặp trong công nghệ thực phẩm là Bacillus và Clostridium. Các loài thuộc giống Bacillus thuộc nhóm hiếu khí bắt buộc hoặc kỵ khí tùy tiện; còn các loài thuộc giống Clostridium thuộc nhóm kỵ khí bắt buộc. - Chúng ta xác định số bào tử trong gia vị thực phẩm, ví dụ như tiêu đen. - Phương pháp thực hiện: · Chuẩn bị mẫu: cân 1g tiêu đen cho vào erlen chứa 99mL peptone. Đặt erlen vào bể điều nhiệt ở 800C trong thời gian 30 phút. Trộn thật đều mẫu và tiến hành pha loãng. · Cấy mẫu: dùng phương pháp cấy mẫu trên môi trường thạch trong hộp petri. · Nuôi cấy: đặt các hộp petri vào tủ ấm, nuôi kỵ khí. Nuôi ở 350C trong 48-72g. - Tính kết quả: tương tự như phương pháp định lượng vi sinh vật trên môi trường đặc. Lê Minh Tâm - 2007 64 VỆ SINH CÔNG NGHIỆP 1. KIỂM TRA VI SINH NGUỒN NƯỚC SẢN XUẤT - Trong thực tế sản xuất, nhà máy thường dựa vào 2 chỉ tiêu cơ bản sau đây: · Tổng số vi khuẩn hiếu khí · Tổng số Coliform và Coliform phân · Dùng E. coli làm vi sinh vật chỉ thị - Một số khái niệm cơ bản: · Coliform là trên gọi chung để chỉ một nhóm vi khuẩn G(-) thuộc họ Enterobacteriaceae. · Có những vi khuẩn thuộc nhóm Coliform không có nguồn gốc từ phân · Điểm khác biệt giữa nhóm Coliform có nguồn gốc từ phân là chúng có thể sinh trưởng ở nhiệt độ 440C. - Môi trường sử dụng: Desoxycholate, Mac Conkey, Violet Red Bile Agar (VRBA) Chú ý: kiểm tra E. coli bằng các thử nghiệm sinh hóa (kiểm tra Indol-dương tính, Methyl red-dương tính, Voges-Proskauer-âm tính, citrate-âm tính) Lê Minh Tâm - 2007 65 2. XÁC ĐỊNH MỨC ĐỘ NHIỄM VI SINH VẬT CỦA KHÔNG KHÍ TRONG PHÂN XƯỞNG SẢN XUẤT - Sử dụng phương pháp đếm khuẩn lạc trên hộp petri chứa môi trường thạch - Lấy mẫu không khí: · Phương pháp truyền thống: đặt các hộp petri trên tại một vài vị trí trong phân xưởng. Tại mỗi vị trí trong phân xưởng, sử dụng 2 hộp petri chứa môi trường thạch tryptone glucose và 2 hộp petri chứa môi trường thạch nấm men, nấm mốc. Thời gian mở nắp hộp để cấy vsv có thể kéo dài đến 1g. · Dùng membrane để vi lọc không khí: lọc không khí bằng membrane; sau đó, đặt membrane vào hộp petri vô khuẩn. Tiến hành tương tự như phương pháp truyền thống. - Nuôi cấy: đối với các hộp petri chứa môi trường thạch tryptone glucose, nuôi ở 370C trong thời gian 24g; hộp petri chứa môi trường thạch nấm men nấm mốc được nuôi ở 300C trong 48g. Lê Minh Tâm - 2007 66 3. XÁC ĐỊNH MỨC ĐỘ NHIỄM VSV CỦA THIẾT BỊ - Kiểm tra: các thiết bị chế biến, thiết bị chứa nguyên liệu, bán thành phẩm, thành phẩm (nguyên liệu hoặc sản phẩm đã bị nhiễm vi sinh vật). - Quy trình vệ sinh: rửa thiết bị bằng nước ® rửa bằng hóa chất (soude) ® rửa bằng nước ® rửa bằng dung dịch có chứa chất diệt khuẩn ® rửa lại bằng nước sạch - Thường kiểm tra chỉ tiêu: tổng số vi khuẩn hiếu khí - Lấy mẫu: · Sử dụng nước rửa thiết bị gieo cấy · Sử dụng miếng gạt để lấy mẫu bề mặt