Thụ tinh trong ống nghiệm ở heo

THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM Ở HEO. A. ĐỊNH NGHĨA VÀ LỢI ÍCH CỦA IVF. I. Định nghĩa: Thụ tinh trong ống nghiệm là quá trình kết hợp giữa tinh trùng với trứng để tạo ra hợp tử ở ngoài cơ thể mẹ - trong phòng thí nghiệm- với môi trường sinh học nhân tạo có các điều kiện thích hợp như : nhiệt độ, độ ẩm, độ nhớt, độ pH, áp suất thẩm thấu các chất dinh dưỡng, các chất kích thích, các ion… cùng với các chỉ tiêu sinh học khác gần giống như trong cơ thể mẹ. II.Lợi ích của IVF Trên thế giới và cũng như ở Việt Nam, quá trình giao phối tự nhiên ở động vật gần như ngày càng bị thay thế bởi quá trình IVF vì: 1. Cải thiện di truyền * Cho phép sử dụng rộng rãi những đực giống nổi tiếng (năng suất cao) và phổ biến nguyên liệu di truyền có giá trị đến tận từng hộ hoặc từng trại chăn nuôi, từ đó cải thiện được năng suất các thế hệ đời sau. * Bằng kỹ thuật IVF có thể làm dễ dàng hơn việc kiểm tra năng suất qua đời sau trong những điều kiện về môi trường và quản lý khác biệt nhau, nhờ đó tiếp tục nâng cao tốc độ và hiệu quả của việc chọn lọc. * Cải thiện được năng suất và tiềm năng của đàn gia súc địa phương, giúp cho việc xây dựng một chính sách, chủ trương về công tác giống của quốc gia. * Cho phép sử dụng tinh dịch đông lạnh của những đực giống cao sản (thậm chí khi chúng đã chết). * Thúc đẩy việc nhập nội nguyên liệu di truyền mới thông qua việc nhập tinh dịch và giảm thấp được chi phí vận chuyển quốc tế (nhờ không nhập đực giống). 2. An toàn dịch bệnh : * Khống chế được lây lan dịch bệnh thông qua giao cấu hoặc do tiếp xúc giữa đực và cái. * Không du nhập bệnh mới nhờ không nhập đực giống. 1 3. Việc theo dõi, ghi chép lai lịch trong công tác quản lý giống sẽ chính xác và nhẹ nhàng. Cho phép dễ dàng lai tạo để thay đổi hướng sản xuất, ví dụ có thể lai tạo để có những con vật kiêm dụng hoặc chuyên dụng tùy theo mục tiêu sản xuất. 4. Tăng nhanh và nhiều số gia súc cái do 1 đực giống phụ trách. Một trâu bò hoặc 1 heo đực giống mỗi năm có thể truyền giống trực tiếp cho 50 - 100 con cái trên một địa bàn nhất định. Nếu lấy tinh đực giống để sử dụng ở dạng tinh dịch lỏng, mỗi năm 1 heo đực có thể phục vụ cho trên 1000 heo cái, 1 trâu bò đực giống có thể phục vụ 3000 - 5000 trâu bò cái trở lên (có những con đến 100.000). Như vậy số đực giống cần nuôi sẽ được giảm thấp, từ đó có điều kiện chọn lọc chỉ giữ lại những con tốt và giảm được chi phí chăn nuôi, chuồng trại, tiết kiệm về kinh tế. 5. Hạn chế những khó khăn hoặc nguy hiểm trong giao phối tự nhiên mà nguyên nhân thường từ phía con đực. Ví dụ : * Ðực giống có thể trọng quá lớn so với con cái; * Ðực giống hung dữ gây tổn thương cho con cái; * Ðực giống bị què, đau chân không nhảy ôm được con cái v.v... 6. IVF đặc biệt cần thiết khi kết hợp với kế hoạch gây động dục đồng loạt. Nó cũng được xem là một biện pháp cần thiết khi kiểm tra tính biệt thông qua việc tách riêng những tinh trùng có mang nhiễm sắc thể X hoặc Y, cũng như cần thiết cho việc nghiên cứu những đặc điểm sinh lý sinh sản của con đực và con cái và phục vụ cho việc thụ tinh trong ống nghiệm. 2 B. SINH LÝ SINH DỤC LỢN I. LỢN ĐỰC: 1. Đặc điểm cấu tạo cơ quan sinh dục lợn đực giống Cơ quan sinh dục của lợn đực giống gồm: Dịch hoàn, dịch hoàn phụ, ống xuất tinh, các tuyến sinh dục phụ (tinh nang, tiền liệt tuyến, cao-pơ) và cơ quan giao phối. a. Dịch hoàn: Lợn đực có hai dịch hoàn hình quả trứng nằm trong bao dịch hoàn. Bên trong của dịch hoàn gồm nhiều vách ngăn, chia dịch hoàn thành nhiều ô nhỏ, trong những ô đó lại có vô số những ống sinh tinh nhỏ, những ống sinh tinh này tập trung lại thành các ống sinh tinh lớn hơn và đi vào giữa dịch hoàn tạo thành thể mạng lưới. Nhiệm vụ của dịch hoàn là sản xuất tinh dịch và các kích tố sinh dục đực. Tinh trùng được sản xuất trong các ống sinh tinh nhỏ, còn kích tố sinh dục đực được sản sinh trong các tế bào kẽ của dịch hoàn. Cấu tạo dịch hoàn 3 b. Dịch hoàn phụ Dịch hoàn phụ là tập hợp các ống sinh tinh để cuối cùng quy tụ thành một ống duy nhất. Một đầu nối liền với đầu của ống dẫn tinh, đầu kia nối liền với ống sinh tinh nhỏ của dịch hoàn. Dịch hoàn phụ là nơi cất giữ tinh trùng, ở đó tinh trùng có thể sống được 1 -2 tháng, dịch hoàn phụ có thể dự trữ được khoảng 200 tỷ tinh trùng (70% nằm ở đuôi dịch hoàn phụ). c. Ống xuất tinh Ống xuất tinh làm nhiệm vụ chính đưa tinh trùng ra ngoài. Vách ống là một loại cơ trơn hoạt động rất mạnh, khi cơ trơn co bóp thì tinh trùng bị đẩy ra ngoài. d.Các tuyến sinh dục phụ: - Tinh nang: Lợn có tinh nang rất phát triển, nằm ở hai bên cầu niệu đạo có hình quả lê dài độ 20 - 25 cm, rộng độ 15 cm. Tác dụng của tinh nang là tiết ra dịch để pha loãng tinh dịch. - Tiền liệt tuyến: Tiền liệt tuyến tiết ra dịch thể pha loãng tinh dịch, làm tăng hoạt tính tinh trùng, trung hòa độ a-xít trung đạo của gia súc cái và CO2 sản sinh ra trong quá trình hô hấp, nó có mùi hắc. - Tuyến Cao - Pơ: Tuyến này tiết ra dịch thể có tính kiềm, tác dụng tẩy rửa nước tiểu ở đường sinh dục con cái để chuẩn bị cho tinh trùng đi qua. Mặt khác, chất tiết của tuyến Cao – Pơ có tính nhờn bôi trơn âm đạo của con cái tạo điều kiện dễ dàng lúc giao phối. e. Dương vật: Dương vật của lợn đực có hình lưỡi khoan, bình thường nó ẩn trong xoang bụng, khi giao phối thì dương vật thò ra ngoài và cương cứng lên. 2. Đặc điểm sản xuất tinh dịch a. Quá trình sinh tinh Quá trình sản sinh ra tinh trùng từ trong ống dẫn tinh nhỏ.Quá trình này được sản sinh liên tục trong dịch hoàn. Vào giai đoạn 50 ngày tuổi sau khi đẻ, trong các ống sinh tinh đã hình thành các tinh bào sơ cấp. Sau thời kỳ này, các biến đổi cơ thể và hormones cũng xuất hiện và thay đổi hình thái, cấu trúc dịch hoàn, các ống sinh tinh to lên nhanh chóng làm tăng nhanh kích thước và khối lượng của tinh hoàn. Ở giai đoạn 150 ngày tuổi, đường kính của các ống sinh tinh đã đạt 130 - 140 µm, 210 ngày tuổi là 210 µm. Từ 3 tháng tuổi trong ống sinh tinh có tất cả các dạng tế bào sinh dục từ tinh nguyên bào đến tiền tinh trùng. Từ 4 tháng tuổi đã có nhiều tinh trùng 4 và tới 8 tháng tuổi thì ống sinh tinh đạt mức ổn định về kích thước. b. Khả năng sản xuất tinh dịch của lợn Lợn đực giống hoạt động sinh dục thuộc loại hình phóng tinh tử cung. Mỗi lần xuất tinh từ 100-500 ml, có khi đến 700 hoặc 800 ml/lần xuất tinh. Tinh dịch của lợn đực gấp 50-100 lần so với trâu bò, dê cừu nhưng mật độ tinh trùng chỉ khoảng 50 ngàn đến 500 triệu/ 1ml tinh dịch. Theo Foote và Kenelly, (1985) thì mật độ tinh trùng của lợn khoảng 200 triệu con/1 ml. Lợn đực có lượng tinh xuất tăng dần theo độ tuổi từ lúc 8 tháng tuổi (80 ml với nồng độ tinh trùng 180-200 triệu con) đến 3 năm tuổi, lợn có lượng tinh xuất một lần khoảng 300 ml với nồng độ từ 250-280 triệu. Số lượng tinh trùng của một lợn đực giống trưởng thành trong một lần xuất khoảng 60 tỷ con. Sau 3 - 4 năm tuổi, lợn đực giống có lượng tinh và nồng độ tinh trùng giảm xuống, nhiều con giảm nhanh nếu như không có qui trình nuôi dưỡng và sử dụng tốt. Vậy nên, các trại chăn nuôi lợn ở nước Úc đã sử dụng lợn đực giống trẻ và trong thời gian khoảng 2 năm, sau đó thanh lý. II.LỢN NÁI 1. Cơ quan sinh dục lợn nái Bộ máy sinh dục của lợn cái gồm hai buồng trứng nằm trong xoang chậu, đường sinh dục bao gồm ống dẫn trứng và vòi trứng (vòi pha lốp), tử cung, cổ tử cung, âm đạo và âm môn Trước khi trứng rụng từng cái một, buồng trứng có sự phát triển, bên trong các bọc chứa tế bào trứng và các chất dịch gọi là bao noãn. Trong khoảng thời gian 16 - 17 ngày đầu của chu kỳ động dục, những bao noãn này phát triển chậm tới lúc đạt kích thước 4 mm. Tiếp theo trong khoảng ngày thứ 4 - 5 trước khi trứng rụng các bao noãn phát triển một cách nhanh chóng để đạt kích thước tối đa 8-10mm. Sự rụng trứng xảy ra khoảng 40 h sau giờ xuất hiện động dục và trứng được phóng vào ống dẫn trứng. Trong ống dẫn trứng chúng sớm được thụ tinh (1/3 phía trên ống dẫn trứng) và phát triển thành hợp tử trước khi vận chuyển đến sừng tử cung làm tổ khoảng 4 ngày sau. Đời sống sinh sản của lợn nái có thể bắt đầu sớm nhất khi nó đạt tới sự thành thục về tính (lần rụng trứng đầu tiên thường khoảng 6- 7 tháng tuổi đối với lợn ngoại, 4 tháng đối với lợn nội) 5 Bộ máy sinh dục lợn cái 6 2. Chu kỳ động dục của lợn nái Biểu hiện các triệu chứng động dục ra bên ngoài và kèm theo quá trình rụng trứng của lợn nái gọi là giai đoạn động dục hoặc là chu kỳ động dục. Ở lợn cái sự thành thục sinh dục xuất hiện từ lúc 6 - 7 tháng tuổi (đối với các giống lợn ngoại) 4-5 tháng (đối với các giống lợn nội). Chu kỳ động dục của lợn cái là khoảng thời gian giữa lần động dục trước đến lần động dục sau. Chu kỳ động dục của lợn cái từ 18-24 ngày, trung bình 21 ngày. Động dục là hiện tượng xuất hiện các triệu chứng động dục như âm hộ sưng lên, có màu đỏ, lợn cái kêu la, phá chuồng, bỏ ăn, tìm con đực, đứng yên, cong đuôi lên và âm hộ tiết ra dịch nhầy, kèm theo quá trình rụng trứng. C. CHUẨN BỊ GIAO TỬ I. LẤY TRỨNG 1. Chọn lọc heo cho trứng. Heo cái khỏe mạnh, không hung dữ, không mắc bất cứ bệnh di truyền nào. Chu kỳ động dục bình thường. Chu kỳ động dục của lợn cái từ 18-24 ngày, trung bình 21 ngày. Bộ phận sinh dục bình thường, không viêm nhiễm. Heo cái phải đạt các tính trạng năng suất mong muốn và có khả năng di truyền các tính trạng này cho đời sau. 2. Khai thác thu thập tế bào trứng. Để có được tế bào trứng hay còn gọi là giao tử cái, có thể thu thập từ ống dẫn trứng sau khi trứng rụng, từ nang trứng của buồng trứng bằng nội soi – siêu âm hoặc bằng giải phẫu những con vật đang còn sống, từ nang trứng của buồng trứng ở những con vật đã bị giết ở lò mổ. a. Thu trứng từ ống dẫn trứng ở heo cái. Trứng có thể rụng tự nhiên hoặc là do sử dụng các hormon kích thích trứng phát triển chín và rụng ( phương pháp siêu bài noãn) Hormon phát triển trứng Ngày của chu kì động dục PMSG (IU) FSH (mg) Hormon rụng trứng HCG (IU) Bò Heo 15 – 16 15 – 16 1500 – 3000 750 - 1500 20 – 50 10 - 20 1500 – 2000 500 - 1000 7 Quy trình gây siêu bài noãn ở bò và heo. ☺ Cách thu trứng : Để thu được trứng, người ta phải phẫu thuật để bộc lộ ống dẫn trứng và sử dụng ống thông để bơm dung dịch PBS vào ống dẫn trứng giội rửa vài lần, sau đó tìm trứng ở dung dịch rửa và phân loại các trứng thu được. ☺ Ưu nhược điểm của cách thu trứng này o Ưu điểm: trứng thu được bằng cách này có tỷ lệ chín cao. o Nhược điểm: việc xác định thời gian thu trứng ở ống dẫn trứng có ý nghĩa quan trọng,nếu muộn quá trứng đã qua thời điểm thụ tinh thích hợp, vì vậy phải thu trứng ở heo cái vào khoảng từ giữa đến cuối động đực là thích hợp nhất. b. Thu trứng từ các nang trứng của buồng trứng. ☺ Ở heo cái đang sống, thường được khai thác trứng nhiều lần để tận dụng triệt để tiềm năng sinh sản của buồng trứng. Các kỹ thuật thu trứng o Kỹ thuật nội soi – siêu âm, người ta sử dụng kim dài xuyên qua thành âm đạo chọc và tìm nang trứng chín để hút tế bào trứng. o Giải phẫu bộc lộ buồng trứng giống như cách thu trứng ở ống dẫn trứng. ☺ Đối với heo cái sắp chết hoặc heo ở lò mổ, người ta thu buồng trứng ngay sau khi mổ trong điều kiện vô trùng và bảo quản trong điều kiện vệ sinh vô trùng và bảo quản trong môi trường thích hợp, vận chuyển nhanh về phòng thí nghiệm và tiến hành thu trứng. o Ở phương pháp này, trứng thu được từ nang trứng non cần được nuôi chín đến khi đạt trạng thái có thể thụ tinh. o Vì vậy, tận thu được số lượng lớn tế bào trứng hơn các phương pháp khác, nhưng đa số trúng không rõ nguồn gốc con mẹ. 3. Phân loại, chọn lọc tế bào trứng. Sau khi thu thập xong, tế bào trứng được phân loại và chọn lọc để nuôi chín và thụ tinh theo hình dáng, kích thước trứng, độ dày của lớp tế bào cumulus còn gọi là tế bào gò trứng bao quanh trứng. Phân loại tế bào trứng theo đặc điểm của lớp tế bào cumulus bao quanh trứng là thực tế và hiệu quả. Hiện nay có 2 kỹ thuật (trực tiếp và gián tiếp) để đánh giá sự trưởng thành của trứng từ phức hợp OCC. + Kỹ thuật đánh giá trực tiếp dựa vào sự sự hiện diện của túi mầm hay thể cực thứ nhất. Cách thứ 2 có liên quan đến việc phân tách khối cumulus bằng enzym. 8 + Kỹ thuật đánh giá gián tiếp thường thông qua các trứng còn gắn khối cumulus, nhìn chung việc đánh giá này thiếu chính xác, tuy nhiên nó đơn giản. Trứng sau khi được thu thập được chia ra làm 3 loại A, B, C dựa trên sự hiện diện và độ dày mỏng của tế bào cumulus. Thường chỉ dùng trứng loại A và B trong IVF. 4. Nuôi trứng trưởng thành Các trứng được lấy trực tiếp từ việc chọc hút nang hoặc từ lò mổ thường chưa trưởng thành, do đó sau khi thu nhận cần phải tiến hành nuôi trứng chín.  Đầu tiên, trứng phải được rửa bằng môi trường thu nhận ( đã được làm ấm 370C) và lần cuối cùng rửa bằng môi trường nuôi chín.  Sau đó đưa trứng vào các giọt môi trường nuôi đã tạo sẵn trên đĩa petri, mỗi giọt thường chứa từ 1- 10 tế bào trứng. Các giọt môi trường này có đệm HEPES, huyết thanh và heparin ( đã ủ ở 370C) Môi trường cho IVM được chia làm 2 loại: đơn giản và phức tạp  Môi trường đơn giản là hệ thống đệm bicarbonate chứa các muối như pyruvate, lactase và glucose. Thường được cung cấp thêm một lượng huyết thanh hay albumin và các kháng sinh ( penicilin, streptomycin và gentamicin).  Môi trường phức tạp cũng chứa các thành phần như môi trường đơn giản và thường có thêm một số yếu tố như amino acid, vitamin, purine và những chất khác. Ngoài ra, môi trường IVM còn được bổ sung hormone (FSH, estradiol, prolactin…). Nhân tố tăng trưởng cũng được bổ sung gồm IGF, EGF, TGF-L. Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến IVM, chẳng hạn nước sử dụng, độ thẩm thấu, nhiệt độ và khí, độ sáng của môi trường, dụng cụ nuôi cấy… II.LẤY TINH TRÙNG II.1 Huấn luyện heo đực giống nhảy giá. Heo đực giống đến tuổi thành thục và đạt mức độ hăng về tính dục có thể huấn luyện nhảy giá để lấy tinh. 1.Tuổi huấn luyện Đực giống khi đưa vào huấn luyện tuổi phải hơi non (tuổi dậy thì) bởi vì ở tuổi này dễ cảm hóa con vật nhưng đồng thời cũng là tuổi con vật có 9 tinh hăng về sinh dục, còn nếu tuổi trưởng thành thi khó huấn luyện hơn vì tính bảo thủ của nó cao. Lợn nội 5-6 tháng tuổi, lợn ngoại 7-8 tháng tuổi. 2.Chế độ chăm sóc nuôi dưỡng Trước khi đưa heo đực giống vào huấn luyện khoảng 20 ngày cần cho ăn khẩu phần ăn phải đảm bảo và cân đối giữa các chất, đặc biệt là protein, canxi, phốt pho và các loại Vitamin A, D, E... Cùng thời gian ấy người huấn luyện phải tiếp xúc với con đực để làm quen bằng cách cho vận động, tắm chải, xoa bóp dịch hoàn. 3.Lịch huấn luyện Phải đảm bảo một tuần không quá hai lần và đúng giờ qui định (tốt nhất là khoảng từ 5-7 giờ sáng). 4.Người huấn luyện Người huấn luyện phải kiên trì tránh nôn nóng, tránh các hành vi thô bạo như : đánh đập và phải luôn cố định người huấn luyện bởi vì có cố định người huấn luyện thì mới theo dõi được cá tính của từng con để chiều theo ý thích của chúng. 5. Phòng và giá huấn luyện Phòng huấn luyện phải rộng đủ cho gia súc đi lại thực hiện các phản xạ. Để làm giá, có thể là “giá tự nhiên” như heo cái (động dục hoặc không động dục), con đực khác; hoặc giá nhân tạo (bằng gỗ, xi măng, sắt, có phủ vải bạt, cao su). 6. Phương pháp huấn luyện * Nguyên tắc huấn luyện Thành lập cho heo đực một phản xạ có điều kiện về nhảy giá và thường xuyên củng cố phản xạ này. Lúc đầu cho nó nhảy với cái động dục, tiếp đó cho nhảy với con mồi, cuối cùng cho nhảy với giá. * Chú ý: - Mỗi giai đoạn nhảy ta cho củng cố 5 đến 6 lần, khi gia súc thành thạo thì ta sẽ chuyển sang giai đoạn khác. - Một số con ta chỉ cần cho nó tham quan sau đó tự nó có thể tự nhảy giá được hoặc có những con khi cho nó vào giá nó nhảy giá ngay thì cho chúng nhảy trực tiếp giá không cần áp dụng một cách máy móc quy trình trên để rút ngắn thời gian huấn luyện. II.2 Một số kỹ thuật lấy tinh. => Các yêu cầu cơ bản trong kỹ thuật lấy tinh. a. Phải khai thác toàn bộ tinh dịch của con đực trong 1 lần khai thác. 10 Nếu việc đó không xảy ra thì nó sẽ gây ra 2 hiện tượng: + Lãng phí tinh dịch + Phản xạ tính dục của heo đực giống bị ảnh hưởng, làm mất khoái cảm sinh dục, dẫn đến làm mất phản xạ có điều kiện đã được tạo nên. b. Đảm bảo phẩm chất của tinh dịch. - Để đạt được về số lượng và chất lượng thì phải đảm bảo các điều kiện sống, sinh lý, chế độ khai thác con đực. Sau khi khai thác xong thì phải đảm bảo điều kiện sống cho tinh trùng khi ra ngoài cơ thể đặc biệt là không được có các tạp khuẩn, các chất sinh học gây ảnh hưởng đến chất lượng tinh trùng. Phải tránh lây lan các bệnh truyền nhiễm, ký sinh trùng thông qua khai thác tinh dịch. Có những chú ý sau về khâu vệ sinh trong quá trình khai thác tinh dịch: + Dụng cụ khai thác tuyệt đối vô trùng. + Không được khai thác tinh dịch của gia súc ốm, bị bệnh. + Phải tắm rửa con đực trước mỗi lần khai thác tinh dịch. + Vệ sinh sạch sẽ giá nhảy, phòng lấy tinh. + Nhân viên lấy tinh dịch phải cố định và không mắc các bệnh truyền nhiễm. c. Không được gây ảnh hưởng thô bạo đến cơ quan sinh đực. d. Dụng cụ an toàn cho cơ quan sinh dục gia súc, dễ thao tác, dễ kiếm và giá thành hạ. => Các kỹ thuật lấy tinh 1. Dùng âm đạo giả. Cấu tạo âm đạo giả gồm hai phần chính: ☺ Phần tiếp nhận dương vật: vỏ và ruột âm đạo giả, các vành đai, lỗ rót nước có van khóa. ☺ Phần hứng tinh dịch: đoạn phễu nối, ống hứng tinh(hoặc lọ, cốc) 11 Điều kiện cần thiết để heo đực giống xuất tinh thuận lợi. ☺ Ôn độ trong lòng âm đạo giả: 38-400C, nhưng cũng tùy cá thể mà bố trí nhiệt độ thích hợp. ☺ Áp lực trong lòng âm đạo giả: 35-70 mm Hg. ☺ Tùy cá thể mà giữ cho lòng âm đạo giả có độ căng thích hợp. Kinh nghiệm: thổi hoặc bơm hơi cho căng bằng miệng ngoài âm đạo giả và tạo thành hình sao 3 cạnh. ☺ Độ trơn trong lòng âm đạo giả: bôi trơn 2/3 mặt trong âm đạo giả bằng vazơlin hoặc tragacăng. Một số dụng cụ lấy tinh => Đây là phương pháp mang tính tối ưu nhất hiện nay, nó có một số ưu nhược điểm chính sau: + Đảm bảo an toàn được cơ quan sinh dục của con đực + Chất lượng tinh dịch được đảm bảo tốt + Dụng cụ phức tạp, chuẩn bị cầu kỳ. 2. Kích thích bằng điện. Ý tưởng băt đầu từ Battelli, năm 1922 trên đối tượng là con lợn, sau đó năm 1936 Gunn (Úc) đã hoàn thiện công trình và rất thành công trên bò. Biện pháp này áp dụng cho những trường hợp heo đực giống không thể nhảy giá được (què), hoặc không quen với âm đạo giả. * Nguyên tắc: Dùng dòng điện xoay chiều kích thích vào hệ thần kinh thực vật của con đực làm hưng phấn cao độ và có phản xạ tính dục. 12 Phương pháp này cho kết quả tốt, được chấp nhận và thực tế sử dụng nhưng không nhiều, lượng xuất tinh giảm. Sau một thời gian sử dụng có thể gây nên bệnh lý. Hiện nay có các máy sử dụng điện hoặc pin của Nga, Mỹ, Pháp. Không nên sử dụng những heo đực giống không có giá trị về di truyền. Nguồn điện sử dụng: 220V, 110V hoặc 12V. 3. Dùng tay để lấy tinh heo đực. Trước đây người ta lấy tinh lợn đực bằng âm đạo giả nhưng ngày nay người ta lấy tinh bằng tay. Sử dụng con đực ở tuổi: 7-9 tháng đối với lợn ngoại, 5-7 tháng đối với lợn nội. Khi heo đực đã nhảy lên giá và thò dương vật ra, dùng bàn tay (mang găng cao su mềm) nắm nhẹ và vân vê phần tự do của dương vật, kích thích cho heo giao cấu trong lòng bàn tay đến khi heo xuất tinh. Phương pháp này có nhiều lợi thế, nhưng cần phải chú ý bảo vệ dương vật heo và phòng ngừa sự lây lan bệnh giữa heo và người. * Chú ý: - Không bịt ngón tay vào lỗ phóng tinh, tinh không bắn ra được. - Cho tinh dịch chảy theo thành cốc hứng tinh. - Trong quá trình lợn phóng tinh tay giữ dương vật để nguyên vị trí và có thể dùng ngón tay cái kích thích vào đầu dương vật để gây kích thích cho lợn xuất tinh tốt hơn. - Khi lấy tinh xong cần phải vệ sinh phòng lấy tinh và dụng cụ. II.3 Tần số lấy tinh. Số lượng tinh trùng và lượng tinh dịch thu được có biến động tùy theo giống, tuổi, tần số lấy tinh. Trong mỗi lần xuất tinh, heo đực tiết ra một số lượng lớn tinh trùng và cũng chóng vơi cạn số tinh trùng dự trữ trong dịch hoàn phụ, vì vậy tần số lấy tinh có ảnh hưởng lớn đến lượng xuất tinh, nồng độ tinh trùng, tổng số tinh trùng tiến thẳng, số liều tinh dịch có thể sản xuất từ một lần lấy tinh. Nếu lấy tinh hằng ngày (mà 4-5 ngày trước đó heo đã được nghỉ xuất tinh), trừ lần xuất tinh đầu tiên, còn các lần sau đều bị giảm về tổng số lượng tinh trùng xuất ra. Do đó, số liều tinh dịch của mỗi lần lấy tinh để sử dụng cũng bị giảm sút. 13 Khoảng cách lấy tinh (giờ) Lượng xuất tinh (ml) Nồng độ tinh trùng (tỉ/ml) Tổng số tinh trùng tiến thẳng (tỉ) Số liều tinh dịch từ một lần lấy tinh (mỗi liều có 1 tỉ tinh trùng) 24 48 72 96 120 144 168 116 166 181 221 256 251 239 0,125 0,145 0,150 0,220 0,220 0,200 0.210 9,7 16,1 27,2 37 45,1 38,7 38,1 9,7 16,1 27,2 37 45,1 38,7 38,1 Ảnh hưởng của tần số lấy tinh II.4 Đánh giá tinh dịch 1. Trạng thái tinh dịch. Tinh dịch phải có trạng thái tương đối đồng nhất, màu trắng sữa đặc, chứng tỏ có nồng độ tinh trùng cao. Tinh dịch trong mờ là tinh dịch chứa ít tinh trùng. Trong tinh dịch không lẫn lông và các vật bẩn khác. Không nên sử dụng tinh dịch đóng vón có chứa những mảnh vật chất hoặc tinh thể vì chứng tỏ đường sinh dục bị viêm nhiễm. Một số heo đực giống thường xuyên xuất ra tinh dịch màu vàng nhạt, chứng tỏ sự có mặt của riboflavin sắc tố vô hại. Tinh dịch có màu xanh là tinh dịch có lẫn mủ, tinh dịch có màu hồng là tinh dịch lẫn máu. Tuổi thọ của tinh trùng giảm dần từ sau khi lấy tinh ra khỏi cơ thể đực giống. Tinh dịch nguyên dạng lỏng phần lớn còn khả năng thụ tinh trong vòng 48 giờ tính từ sau lúc lấy tinh. Vì vậy sau khi lấy tinh cần tiến hành ngay các khâu đánh giá chất lượng tinh dịch để quyết định việc pha loãng bảo tồn tiếp theo. Thao tác đánh giá càng nhanh và càng chính xác càng tốt. 2. Các phương pháp đánh giá tinh dịch. a. Nồng độ tinh trùng Là số tinh trùng trong 1ml tinh dịch. Việc xác định chính xác nồng độ tinh trùng là rất quan trọng vì chỉ tiêu này thường biến động lớn. Khi phối hợp giữa lượng xuất tinh, sức hoạt 14 động tinh trùng và nồng độ tinh trùng, sẽ có được tổng số tinh trùng tiến thẳng trong tinh dịch, từ đó sẽ tính được số liều tinh dịch có thể sản xuất của mỗi lần xuất tinh. Cho đến nay phương pháp xác định nồng độ tinh trùng được tín nhiệm là dùng buồng đếm bạch cầu. Buồng đếm Niubaoơ Thứ tự đếm tinh trùng: Trên xuống, từ trái sang phải Ngoài buồng đếm còn có ống karras, máy so màu quang điện. 15 Ống Karas b. Sức kháng thẩm thấu của tinh trùng (Ro) Nguyên tắc: dựa trên sự đánh giá sức chịu đựng của tinh trùng đối với dung dịch NaCl nhược trương. Nếu tinh trùng chịu đựng được dung dịch NaCl nhược trương sau 3 giờ mà sức hoạt động vẫn còn tốt, chứng tỏ chất lượng tinh dịch tốt. Cách làm: dùng NaCl 0,8%, pha loãng 1:4, bảo tồn ở nhiệt độ phòng và kiểm tra hoạt lực tại các thời điểm: 0 giờ (lúc mới pha loãng), 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ ( sau khi pha loãng). Cộng 4 giá trị hoạt lực ấy, mẫu tinh dịch nào có giá trị tổng hoạt lực càng cao, chất lượng tinh dịch càng tốt. c. Tỉ lệ tinh trùng sống/chết. Có thể đánh giá tỉ lệ sống/chết của tinh trùng bằng cách nhuộm tinh trùng đang còn sống trong hỗn hợp nigrosin-eosin. Khi nhuộm, nếu tinh trùng còn sống thì đầu tinh trùng không bắt màu, còn nếu tinh trùng chết thì đầu tinh trùng bắt màu hồng trên nền thẫm của nigrosin. Phương pháp phết tiêu bản. Thông thường tỉ lệ tinh trùng của heo sống đạt ≥70% trở lên chứng tỏ tinh dịch tốt, sử dụng đạt hiệu quả cao. 16 d. Độ pH tinh dịch Độ pH của tinh dịch có liên quan đến khả năng sống và năng lực thụ tinh của tinh trùng. Để xác định độ pH , chính xác nhất là dùng máy đo pH. Ngoài ra trong thực tiễn vẫn có thể dùng giấy chỉ thị màu, phương pháp này nhanh, rẻ tiền nhưng độ chính xác không cao. Cách đo pH bằng giấy chỉ thị màu: nhúng ngập giấy chỉ thị vào tinh dịch và so kết quả chuyển màu của giấy đối với thang màu. Đọc kết quả trong vòng 5 giây. Độ pH tinh dịch heo khoảng 7,2-7,5. e. Tình trạng acrosome của tinh trùng. Acrosome có vai trò quan trọng đối với năng lực thụ tinh của tinh trùng. Các nhân tố lý hóa học, bệnh lý… dễ dàng làm cho acrosome bị tổn thương. Kỹ thuật đông lạnh không đúng đắn cũng có thể phá hủy acrosome và màng bọc tinh trùng, làm thất thoát các enzyme trong tế bào. Có nhiều phương pháp đánh giá tình trạng acrosome ☺ Đánh giá nhanh một cách khái quát: thường dùng các dung dịch có thể làm cho một số thành phần trong acrosome ph