Nghiên cứu tác dụng kháng ung thư của chất ct-1 chiết xuất từ cây khổ sâm cho lá trên chuột thiếu hụt miễn dịch

TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2014 19 NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƢ CỦA CHẤT CT-1 CHIẾT XUẤT TỪ CÂY KHỔ SÂM CHO LÁ TRÊN CHUỘT THIẾU HỤT MIỄN DỊCH Trịnh Hồng Anh*; Cao Minh Hưng*; Hồ Anh Sơn**; Nguyễn Lĩnh Toàn** Phương Thiện Thương*; Nguyễn Minh Khởi*; Lê Tuấn Anh* TÓM TẮT Với liều 50 mg/kg thể trọng, chất CT-1 chiết xuất từ cây Khổ sâm cho lá có tác dụng dự phòng và điều trị ung thư phổi người tế bào không nhỏ (UTPNTBKN) trên chuột thiếu hụt miễn dịch, thể hiện: - Sau khi ghép tế bào (TB) ung thư, nhóm dự phòng có 20% chuột không xuất hiện khối u, trong khi nhóm chứng và nhóm điều trị 100% xuất hiện khối u. - Kích thước khối u ở nhóm điều trị nhỏ hơn nhóm chứng ở mọi thời điểm theo dõi. - Sau 3 tháng theo dõi, tỷ lệ chuột chết ở nhóm chứng là 100%, nhóm dự phòng 60%, nhóm điều trị 40%. * Từ khóa: Khổ sâm cho lá; Độc tính cấp; Độc tính bán trường diễn. Research about Anticancer of CT-1 Extracted from Croton tonkinensis Gagnep on Nude Mice Summary CT-1 extracted from Croton tonkinensis Gagnep with dose of 50 mg/kg has the effective in prevention and treatment of lung cancer on nude mice: - After cancer cell transplantation, 20% of mice in control group had no tumor, 100% of mice in prevention and treatment groups had tumor. - The volume of tumor in treatment group was smaller than the other groups at any times. - After 3 months: control goup: 100% of nude mice dead, prevention group: 60% of nude mice dead, treatment group: 40% of nude mice dead. * Key words: C. tonkinensis; Acute toxicity; Semi-chronic toxicity. ĐẶT VẤN ĐỀ Cây Khổ sâm cho lá có tên khoa học là Croton tonkinensis Gagnep, thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae), là một loại cây đặc hữu của Việt Nam được sử dụng làm thuốc chữa sốt rét, mẩn ngứa, lở loét, đau bụng đi ngoài (lỵ cấp tính), ăn không tiêu, viêm loét tá tràng, đau dạ dày. * Trường Đại học Khoa học Tự nhiên ** Học viện Quân y *** Viện Dược liệu Người phản hồi (Corresponding): Hồ Anh Sơn ([email protected]) Ngày nhận bài: 10/11/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 27/11/2014 Ngày bài báo được đăng: 28/11/2014 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2014 20 Các nghiên cứu về thành phần hóa học của cây Khổ sâm cho lá bắt đầu khoảng 20 năm trở lại đây cho thấy thành phần hóa học chính của lá Khổ sâm cho lá là ent-kauranediterpenoid, điển hình là ent-18-acetoxy-7β-hydroxy..kaur-15-oxo- 16-ene (tạm gọi là chất CT-1), có hàm lượng khoảng 293,05 µg/g [3]. Chất này có tác dụng ức chế sự phát triển của nhiều dòng TB ung thư trên in vitro, g m thư v MCF-7, ung thư phổi NCI-H460 [6], ung thư gan SK-HEP1 [7], ung thư đại tràng Caco-2 và LS180 trên in vitro [8]. Sử dụng chuột thiếu hụt miễn dịch (gọi tắt là chuột nude) là một bước đột phá trong nghiên cứu ung thư, cho phép nghiên cứu ung thư người trên cơ thể động vật. Chuột nude có một gen bị đột biến đ ng hợp tử (homozygous), gen này quy định sự phát triển của lông và tuyến ức. Do đó, với gen bị đột biến, chuột nude có tuyến ức bị suy giảm chức năng hoặc thậm chí không có tuyến ức, không có lông và hệ thống đáp ứng miễn dịch TB bị hạn chế do suy giảm mạnh số lượng TB lympho T. Nhờ vậy, khi ghép TB ung thư người lên chuột nude, khối u phát triển không bị đào thải do yếu tố miễn dịch của chuột và khối u mang đặc tính sinh học khá tương đ ng với khối ung thư trên cơ thể người. Để đánh giá tác dụng kháng ung thư trên mô hình in vivo, ch ng tôi thực hiện đề tài này nhằm: Đánh giá tác dụng kháng ung thư của chất CT-1 chiết xuất từ cây Khổ sâm cho lá trên mô hình chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối ung thư phổi người. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Vật liệu nghiên cứu. - Chuột thiếu hụt miễn dịch: 30 con. - TB UTPNTBKN (adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells) A549 (Công ty ATCC, Hoa Kỳ). - Môi trường nuôi cấy TB ung thư. - Thước đo kích thước khối u, tủ nuôi cấy TB. - Chất CT-1 thu được từ quá trình chiết xuất, phân lập từ lá của cây Khổ sâm cho lá. 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. * Nuôi cấy TB ung thư và tạo khối u trên chuột: TB UTPNTBKN A549 được nuôi cấy trong môi trường Eagle’s minimum essential medium, bổ sung fetal bovine serum 10%, 1% penicillin và streptomycin (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, CHLB Đức), 1,5 mcg insulin/ml môi trường. Mỗi chai nuôi cấy diện tích 75 cm2 chứa 106 TB. TB được nuôi cấy tăng sinh và thay môi trường 2 lần/tuần ở điều kiện nhiệt độ 370C, CO2 5%. Khi TB phát triển đạt 80% diện tích, tiến hành cấy chuyển sang chai mới. Tách TB và đếm, thu TB với n ng độ 107 TB/ml để phục vụ các thử nghiệm tiếp theo. Chuẩn bị TB trước ghép: TB trước khi tách được rửa hai lần bằng dung dịch PBS 1X, sau đó tách bằng dung dịch trypsin-EDTA 1X. Dung dịch TB ung thư đã chuẩn bị được h t vào bơm tiêm 1 ml với số lượng 107/ml. Cố định chuột nude và tiêm 0,1 ml vào dưới da đùi phải (106 TB/chuột). Quá trình thao tác thực hiện trong điều kiện vô trùng tuyệt đối. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2014 21 * Đánh giá hiệu quả dự phòng và điều trị ung thư của CT-1: - Phân nhóm: 30 chuột nude, phân thành 3 nhóm: + Nhóm dự phòng: 10 con, uống CT-1 với liều 50 mg/kg cân nặng/ngày, trong 2 tuần liên tục trước khi ghép TB tạo khối ung thư. + Nhóm điều trị: 10 con, uống CT-1 với liều 50 mg/kg cân nặng/ngày, trong 2 tuần liên tục sau khi có khối ung thư. + Nhóm chứng: 10 con, uống nước cất với thể tích 0,1 ml/10 g cân nặng/ngày, trong 2 tuần liên tục sau khi có khối ung thư. - Sau khi ghép TB, xuất hiện khối u, phân riêng chuột nhóm dự phòng, những chuột còn lại được chia ngẫu nhiên thành 2 nhóm điều trị và nhóm chứng và bắt đầu cho uống thuốc. - Đánh giá theo dõi sự phát triển khối u tại vị trí tiêm (đùi phải) 2 lần/tuần bằng quan sát, sờ nắn và đo kích thước bằng thước chính xác NSK. + Kích thước khối u: đo theo 2 kích thước dài x rộng bằng thước chính xác NSK (Nhật Bản) 01 lần/tuần. Kích thước u được tính theo công thức: V = D x R2 x 0,5 (Yamaura và CS, 2000), trong đó: V: thể tích khối u; D: chiều dài khối u; R: chiều rộng khối u. Quá trình đánh giá kích thước khối u dừng lại khi có chuột chết ở bất kỳ nhóm nào, những con khác vẫn được theo dõi để xác định thời gian sống thêm. + Thời gian sống của các nhóm: thời gian sống của chuột được tính từ sau khi ghép TB ung thư. Quá trình theo dõi thời gian sống của mỗi nhóm chuột dừng lại khi toàn bộ chuột của nhóm chứng đều chết. - Các chỉ tiêu đánh giá: + Tỷ lệ xuất hiện khối u. + Kích thước khối u trung bình của các nhóm. + Tỷ lệ chết sau theo dõi. KÕt qu¶ nghiªn cøu vµ bµn luËn 1. Tác dụng dự phòng ung thƣ của CT-1. 80% 100% 100% 0% 20% 40% 60% 80% 100% 120% Nhóm dự phòng Nhóm chứng Nhóm điều trị Biểu đồ 1: Tỷ lệ xuất hiện khối u sau ghép TB ung thư ở các nhóm (n = 10). TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2014 22 Cho chuột thiếu hụt miễn dịch uống chất CT-1 với liều 50 mg/kg/ngày trong 2 tuần liên tục, sau đó ghép 106 TB A549/con. Trong số 10 chuột nhóm này, 8 chuột phát triển khối u, 2 chuột (20%) không phát triển khối u (sau 2 tuần ghép TB). Đối với nhóm chứng và nhóm điều trị, 100% chuột đều có khối u phát triển. Điều đó cho thấy chất CT-1 có thể có tác dụng dự phòng ung th- phæi. 2. Tác dụng của CT-1 lên kích thƣớc khối u. Biểu đồ 2: Kết quả theo dõi thể tích khối u qua các thời điểm nghiên cứu. Chuột sau khi hình thành khối u (ở ngày thứ 7), kích thước khối u ở 3 nhóm tương đương nhau. Tiếp tục theo dõi kích thước khối u ch ng tôi nhận thấy: nhóm điều trị bằng CT-1 có tác dụng cải thiện rõ rệt trong kìm hãm tốc độ phát triển của khối u, thể hiện kích thước khối u của nhóm điều trị luôn nhỏ hơn nhóm chứng và nhóm dự phòng ở mọi thời điểm theo dõi. Nhóm dự phòng, kích thước khối u có xu hướng nhỏ hơn, tuy nhiên chưa có sự khác biệt đáng kể so với nhóm chứng. Điều đó chứng tỏ, chất CT-1 không chỉ có tác dụng dự phòng ung thư phổi mà còn có tác dụng ức chế sự phát triển của TB ung thư phổi trên chuột thiếu hụt miễn dịch. - Hình ảnh đại thể: Nhóm chứng Nhóm dự phòng Nhóm điều trị Ảnh 1: Hình ảnh khối u của 3 nhóm tại thời điểm bắt đầu theo dõi. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2014 23 Khối u của các nhóm tại thời điểm bắt đầu theo dõi có kích thước tương đ ng. Khối u của nhóm chuột được phân ngẫu nhiên, có kích thước trung bình khoảng 70 mm3. Khối u có bờ rõ, cứng chắc, ít di động. Da phía trên không thay đổi màu sắc. Nhóm chứng Nhóm dự phòng Nhóm điều trị Ảnh 2: Hình ảnh khối u của các nhóm tại thời điểm 35 ngày sau điều trị. Sau 35 ngày điều trị, kích thước khối u khác biệt đáng kể giữa các nhóm. 3. Thời gian sống dƣ của chuột sau ghép TB ung thƣ. Thời gian sống dư của các nhóm: thời gian sống dư của chuột tạm được coi từ sau khi ghép TB ung thư. Trong suốt thời gian này, ngoài việc đo kích thước khối u, ch ng tôi còn theo dõi các biểu hiện bất thường khác như liệt, chết. Quá trình theo dõi thời gian sống dư của mỗi nhóm chuột dừng lại khi toàn bộ chuột của nhóm chứng đều chết. Biểu đồ 3: Biểu diễn thời gian sống của các nhóm chuột. Sau 3 tháng, toàn bộ chuột ở nhóm chứng chết, thống kê thời gian sống dư của từng nhóm, so sánh tỷ lệ chuột chết. Nhóm điều trị còn 60% chuột sống (6 con), nhóm dự phòng còn 40% (4 con, trong đó 2 con không mọc u). Như vậy, chất CT-1 có tác dụng kéo dài thời gian sống dư đối với chuột nude mang khối ung thư phổi người. KẾT LUẬN Đánh giá tác dụng của chất CT-1 chiết xuất từ cây Khổ sâm cho lá trên chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối ung th- phæi người ch ng tôi nhận thấy: TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2014 24 Với liều 50 mg/kg thể trọng, chất CT-1 bước đầu cho thấy có tác dụng dự phòng và điều trị ung thư phổi không biệt hóa TB nhỏ, thể hiện: - Nhóm dự phòng có 20% chuột không xuất hiện khối u, trong khi nhóm chứng và nhóm điều trị 100% đều xuất hiện khối u. - Kích thước khối u ở nhóm điều trị nhỏ hơn nhóm chứng ở mọi thời điểm theo dõi. - Sau 3 tháng theo dõi, tỷ lệ chuột chết ở nhóm chứng là 100%, nhóm dự phòng 60%, nhóm điều trị 40%. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Nguyễn Đình Bảng, Hồ Anh Sơn, Nguyễn Lĩnh Toàn. Nghiên cứu tạo khối ung thư tuyến tiền liệt người trên chuột nude “nude mice” bằng kỹ thuật ghép dị loài. Tạp chí Y - Dược học Quân sự. 2011, 2. 2. Phan Minh Giang, Phan Tống Sơn. Xác định hoạt chất ent-kauranditerpenoid trong cây Khổ sâm cho lá (Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae) bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao. Tạp chí Dược học. 2011, 8, tr.29-33. 3. Phan Minh Giang, Phan Tống Sơn. Hoạt tính gây độc TB của các ent-kauranditerpenoid từ cây thuốc Khổ sâm cho lá (Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae). Tạp chí Dược học. 2011, 419, tr.24-27. 4. Phương Thiện Thương, Đào Trọng Tuấn, Phạm Thị Hồng Minh, Nguyễn Thị Bích Thu, Nguyễn Minh Khởi. Tổng quan các nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây Khổ sâm cho lá. Hà Nội. 2014. 5. Phan Minh Giang, Phan Tong Son, Hamada Y, Otsuka H. Cytotoxic Diterpenoids from Vietnamese medicinal plant Croton tonkinensis Gagnep. Chem Pharm Bull. 2005, 53 (3), pp.296-300. 6. Phan Minh Giang, Phan Tong Son, Lee JJ, Otsuka H. Four ent-kaurane-type diterpenoids from Croton tonkinensis Gagnep. Chem Pharm Bull. 2004, 52, pp.879-882. 7. ATCC. dvancedCatalogSearch/ProductDetails/tabid/452/ Default.aspx?ATCCNum=30-500K&Template= bioproducts. 8. ATCC. CatalogSearch/ProductDetails/tabid/452/Default .aspx?ATCCNum=HTB- 22&Template=cellBiology. 9. Nguyen Minh Khoi, Phuong Thien Thuong, Saho Ohta, Shinichiro Shiota, Hironori Kanta, Kenji Takeuchi, Fumiaki Ito. An ent-kauran diterpenoid from Croton tonkinensis Induce Apoptosis in Colorectal cancer cell through the phosphorylation of JNK mediated by reactive oxygen species and dual - specificity JNK kinase MKK4. Anticancer Agent in Medicinal Chemistry. 2014, 14, pp.1051-1061.