Phản ứng kết hợp kháng nguyên - Kháng thể

72 Chương 7 PHẢN ỨNG KẾT HỢP KHÁNG NGUYÊN - KHÁNG THỂ I. Cơ chế kết hợp kháng nguyên - kháng thể Sự kết hợp kháng nguyên-kháng thể dịch thể đặc hiệu nhờ vào các lực liên kết lý hóa sau: * Lực liên kết các phân tử với nhau hay còn gọi là lực liên kết Wander-Wals. * Lực hút tĩnh điện giữa các nhóm chức khác nhau. Ví dụ giữa nhóm amin và nhóm carboxyl. * Lực liên kết giữa các cầu nối hydro với nhau * Lực kỵ nước Phản ứng kết hợp giữa kháng nguyên kháng thể không phải là một phản ứng hóa học hoàn toàn, nên người ta có thể tách trở lại các thành phần kháng nguyên và kháng thể. II. Phản ứng ngưng kết - Agglutination test 1. Nguyên lý Đây là phản ứng với các kháng nguyên hữu hình (ví dụ như xác vi khuẩn). Khi găp kháng thể đặc hiệu, các kháng nguyên sẽ kết lại với nhau thành đám lớn mà mắt thường có thể quan sát được. Đó là hiện tượng ngưng kết trực tiếp, Khi cơ thể được miễn dịch, trong huyết thanh có chứa nhiều kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên tương ứng. Khi cho kháng nguyên hữu hình trộn với kháng thể đặc hiệu tương ứng, thì các vi khuẩn sẽ kết lại với nhau qua cầu nối kháng thể đặc hiệu. Do mỗi cầu nối với các kháng nguyên dưới hình thức mạng lưới nhiều chiều, tạo nên những đám ngưng kết biểu hiện 73 bằng những đám lấm tấm hoặc lổn nhổn những hạt cát hoặc những cụm bông lơ lửng. Các phản ứng ngưng kết thường đơn giản, dễ làm, có độ nhạy cao, không tốn kém, được sử dụng rộng rãi, nhưng có nhược điểm là khó đạt trình độ chính xác cao, thường hay cho phản ứng dương tính giả. 2. Các loại phản ứng ngưng kết 2.1. Phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính Là phản ứng có tính chất định tính, thường sử dụng kháng nguyên đã biết và nhuộm màu để phát hiện kháng thể tương ứng trong huyết thanh. Hình 20: Phản ứng ngưng kết A - Không xẩy ra khi cả 2 vị trí của IgG đều gắn vào một xác vi khuẩn B - Xảy ra khi IgG trở thành cầu nối giữa các xác vi khuẩn C - Rất dễ xảy ra khi kháng thể là loại IgM 74 Dùng một phiến kính, nhỏ một giọt huyết thanh cần chẩn đoán, sau đó nhỏ vào một giọt kháng nguyên đã biết, trộn đều, sau đó vài phút đọc kết quả, nếu trong huyết thanh có kháng thể tương ứng, thì kết hợp kháng nguyên kháng thể tạo thành đám ngưng kết, nếu kháng nguyên được nhuộm màu, thì đám ngưng kết có màu cụm lại, xung quanh nhạt màu hơn. 2.2. Phản ứng ngưng kết chậm trong ống nghiệm Là phản ứng vừa có tính định tính vừa có thể định lượng được hàm lượng kháng thể. Dùng một loạt ống nghiệm, mỗi ống cho vào một lượng không đổi huyết thanh có độ pha loãng khác nhau theo cơ số 2 (1/2, 1/4, 1/8, 1/16..) hoặc theo cơ số 10 (1/10, 1/100, 1/1000, 1/10.000..) sau đó cho vào mỗi ống nghiệm một lượng tương đương kháng nguyên, để ở nhiệt độ thích hợp theo yêu cầu của phản ứng, sau 30 phút hoặc vài giờ đọc kết quả và tính được hiệu giá ngưng kết. Hiệu giá ngưng kết là độ pha loãng cao nhất mà ở đó vẫn xảy ra hiện tượng ngưng kết. 2.3. Phản ứng ngưng kết hồng cầu thụ động Khi dùng một kháng nguyên hòa tan để phát hiện một kháng thể tương ứng trong phản ứng ngưng kết, phải cần đến tế bào mang, người ta thường dùng hồng cầu, hạt chất dẻo như hạt latex, bentonit Nguyên lý: Làm cho kháng nguyên hòa tan trở thành kháng nguyên hữu hình, bằng cách gắn kháng nguyên vào hồng cầu, như vậy hồng cầu đóng vai trò là giá đỡ cho kháng nguyên, khi kháng nguyên đã gắn trên hồng cầu thì kháng nguyên đó trở thành kháng nguyên hữu hình và phản ứng ngưng kết xảy ra dễ dàng. Có nhiều phương pháp để gắn kháng nguyên hòa tan trên bề mặt hồng cầu. Có thể xử lý bằng các hóa chất như a xít tanic, benzidin, các muối crom, glutaraldehyd.. các hóa chất này có một nhóm chức gắn với hồng cầu và nhóm chức còn lại gắn với kháng nguyên.. 75 Khi có phản ứng xảy ra, nghĩa là khi có kháng thể tương ứng với kháng nguyên, thì các kháng thể sẽ nối các kháng nguyên lại và các kháng nguyên đã gắn với hồng cầu hoặc đã hấp phụ vào các hạt chất dẻo, tạo nên sự ngưng kết nhìn thấy rõ ràng. 2. 4. Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (Phản ứng HI) Nguyên lý: Một số loại vi rút (vi rút cúm, vi rút Newcastle) có đặc tính gây ngưng kết hồng cầu của một số loài gia súc gia cầm. Nếu gặp kháng thể đặc hiệu tương ứng, thì vi rút bị kháng thể trung hòa, không còn vi rút để tiếp xúc với hồng cầu, hay nói cách khác, kháng thể đã ngăn trở ngưng kết hồng cầu của vi rút. Còn nếu vi rút không gặp kháng thể đặc hiệu tương ứng, vi rút sẽ không bị trung hòa và vi rút sẽ làm hồng cầu ngưng kết lại với nhau. - Phương pháp tiến hành phản ứng: thường dùng vi rút đã biết để làm phản ứng HI với huyết thanh cần chẩn đoán. Phản ứng vừa có tính chất định tính vừa có tính chất định lượng. Vi rút được pha với nồng độ 4 đơn vị HA (Haemagglutination). Hình 21. Phản ứng ngưng kết hồng cầu thụ động 76 Huyết thanh được pha loãng theo cơ số 2: 1/2, 1/4, 1/8, 1/16.. hoặc theo cơ số 10 : 1/10, 1/100, 1/1000, 1/10000.. Cho hỗn hợp vi rút và huyết thanh ở mỗi nồng độ với lượng nhất định, để ở nhiệt độ thích hợp. Sau một thời gian 10-20 phút, cho một lượng hồng cầu pha loãng từ 0,5-1% với một lượng nhất định vào tất cả các ống. Đọc kết quả sau 15-30 phút Phản ứng dương tính: Hồng cầu lắng xuống đáy thành cục tròn đỏ, chứng tỏ huyết thanh tương ứng với vi rút. Phản ứng âm tính: Hồng cầu bị ngưng kết thành mạng, chứng tỏ huyết thanh không tương ứng với vi rút, nên vi rút đã làm ngưng kết hồng cầu. III. Phản ứng kết tủa (Precipitation test) 1- Nguyên lý: Giống phản ứng ngưng kết, chỉ khác là kháng nguyên trong phản ứng này là kháng nguyên hòa tan được trộn với kháng thể dịch thể tương ứng, cũng là chất hòa tan trong huyết thanh. Nếu thiếu hoặc thừa một trong 2 thành phần này thì sự kết tủa khó xảy ra, sự kết tủa biểu hiện bằng chất cặn màu sáng trắng dễ quan sát được. Phản ứng kết tủa cũng cần có một số điều kiện như: nhiệt độ, pH, các ion môi trường điện giải.. 1. Phản ứng kết tủa trong môi trường lỏng 1.1. Phản ứng kết tủa vòng Là phản ứng có tính chất định tính. Dùng ống nghiệm loại nhỏ, cho kháng nguyên hòa tan vào trước, sau đó dùng pipet đã hút huyết thanh có kháng thể tương ứng, để đầu mút pipet vào sát đáy ống nghiệm rồi nhỏ từ từ cho kháng thể vào, với một lượng tương đương, kháng thể sẽ đội kháng nguyên lên (vì là kháng nguyên hòa tan nên nhẹ hơn kháng thể). 77 Để yên trong vòng 15-20 phút sẽ thấy xuất hiện vòng kết tủa màu trắng ở chỗ tiếp xúc giữa lớp kháng nguyên và kháng thể, nếu kháng nguyên và kháng thể tương ứng (hình 23a). Người ta thường dùng kháng thể dịch thể chuẩn đã biết để chẩn đoán kháng nguyên chưa biết với điều kiện kháng nguyên đó phải được chiết xuất thành dung dịch hòa tan. Phản ứng kết tủa vòng được ứng dụng nhiều trong chẩn đoán bệnh nhiệt thán, gọi là phản ứng kết tủa của Ascoli (hình 23b). Dung dịch kháng nguyên Vòng ngưng kết Kháng huyết thanh Kháng huyết thanh 0,5ml Kháng nguyên 0,5ml Kháng nguyên âm 0,5ml Kháng nguyên Vòng trắng đục Kháng huyết Kháng nguyên âm Hình 22a. Phản ứng kết tủa vòng Hình 22b. Phương pháp làm phản ứng Ascoli 78 1.2. Phản ứng kết tủa trong ống nghiệm Là phản ứng vừa có tính định tính, vừa có tính định lượng. Dùng một loạt ống nghiệm, cho huyết thanh đều vào các ống nghiệm đó, sau đó cho kháng nguyên vào với lượng từ ít đến nhiều. Kết quả sẽ thấy có kết tủa xảy ra càng rõ tại những ống có kháng nguyên vừa đủ với kháng thể, còn ở những ống có thừa kháng nguyên thì kết tủa không xảy ra. 1.3. Phản ứng kết tủa trong môi trường đặc Cho kháng nguyên và kháng thể gặp nhau trong môi trường thạch và quan sát đường kết tủa. Kháng nguyên Vùng trung gian Kháng thể Hình 23. Miễn dịch khuếch tán đơn (A) và miễn dịch khuếch tán kép (B) trong ống nghiệm 79 Nguyên lý: Lợi dụng tính chất khuếch tán của chúng về phía nhau, rồi gặp nhau, kết hợp với nhau bão hòa và kết tủa ở vùng có tỷ lệ tương ứng đồng đều giữa kháng nguyên và kháng thể. Phản ứng kết tủa khuếch tán trong thạch ống nghiệm (Kỹ thuật Oudin): Có thể chia làm hai loại: Phản ứng kết tủa khuếch tán đơn và kép. Phản ứng kết tủa khuếch tán trong thạch đơn Thạch đã trộn sẵn kháng thể (hoặc kháng nguyên) rồi cho vào trong ống nghiệm trước, sau đó cho lên mặt thạch một lượng dung dịch kháng nguyên (hoặc kháng thể). Kháng nguyên (hoặc kháng thể) sẽ khuếch tán vào trong thạch đi xuống phía dưới và sẽ gặp kháng thể (hoặc kháng nguyên) đã có trong đó kết hợp, bão hòa, và kết tủa thành đường màu trắng. Nếu dùng nhiều đôi kháng nguyên và kháng thể khác nhau trong cùng một ống nghiệm để chẩn đoán thì sẽ xuất hiện nhiều đường kết tủa riêng rẽ ở độ nông sâu khác nhau theo từng cặp kháng nguyên-kháng thể tương ứng. 1.4. Phản ứng kết tủa khuếch tán trong thạch kép Cho kháng thể vào trước, rồi cho vào trên kháng thể một lớp thạch bình thường: (không chứa kháng nguyên, kháng thể). Sau đó cho lên mặt thạch dung dịch kháng nguyên hòa tan (hoặc là ngược lại). Kháng nguyên bên trên sẽ khuyêch tán xuống dưới và đi vào trong thạch, và kháng thể bên dưới khuếch tán lên trên cũng đi vào trong thạch, gặp nhau ở một nơi nào đó, kết hợp bão hòa và kết tủa. Phản ứng kết tủa khuếch tán trong thạch trên phiến kính hoặc trên đĩa petri, khi thạch đông đặc, đục các lỗ tròn nhỏ có kích thước và khoảng cách bằng nhau, tthường đục một cụm 6 lỗ, 1 lỗ trung tâm và 5 lỗ xung quanh. 80 Nhỏ vào lỗ trung tâm kháng nguyên hoặc kháng thể chuẩn đã biết, còn các lỗ xung quanh nhỏ kháng thể hoặc kháng nguyên cần chẩn đoán, chúng sẽ khuếch tán về phía nhau và xuất hiện vạch kết tủa, nếu kháng nguyên và kháng thể tương ứng. I II Hình 24a (Theo Ian R. Tizard. 2004) I. Định hiệu giá huyết thanh II. Định hiệu gía kháng nguyên 1 - Kháng nguyên 1 - Kháng thể 2, 3, 4, 5, 6 - kháng thể pha loãng 2, 3, 4, 5, 6 - kháng thể pha loãng lần lượt từ: 1/2, 1/4, 1/8, 1/32 lần lượt từ: 1/2, 1/4, 1/8, 1/32 I II Hình 24b (Theo Ian R. Tizard. 2004) I. Định loại kháng nguyên II. Định loại kháng thể 1 - Kháng thể đã biết 1- Kháng nguyên đã biết 2, 3, 4, 5 - kháng nguyên chưa biết 2, 3, 4, 5 - kháng thể chưa biết 6 - kháng nguyên tương ứng 6 - kháng thể tương ứng Phản ứng dương tính Phản ứng âm tính 81 Hình 24c. Phản ứng kết tủa khuyếch tán làm trên đĩa lồng (Theo Ian R. Tizard. 2004) A B C Hình 25. Hiện tượng hai kháng nguyên: Không đồng nhất (A); đồng nhất (B); đồng nhất một phần (C) phát hiện bằng phản ứng Ouchterlony 82 Nhận định kết quả được căn cứ vào đường kết tủa, có thể có 3 trường hợp sau: Các lỗ chứa kháng nguyên đều đồng nhất và tương ứng với kháng thể thì các đường kết tủa sẽ gặp nhau và nối liền nhau. Nếu hai lỗ chứa kháng nguyên chỉ có một phần tương ứng với một phần khác của kháng thể thì sẽ xuất hiện hai đường kết tủa cắt nhau, tức là các kháng nguyên không có liên quan với nhau. Nếu 2 lỗ chứa kháng nguyên có liên quan một phần cùng có chung một nhóm quyết định X (KN XY và KNXZ) phản ứng với một hỗn hợp kháng thể chống XY, sẽ tạo ra 2 đường kết tủa gặp nhau, nhưng một đường dài và một đường ngắn hơn (giống hình cựa gà). 1.5. Phương pháp điện di miễn dịch (Electrophoresis) Là phương pháp cải tiến của phương pháp kết tủa khuếch tán trong thạch nhưng sử dụng điện trường để cho kháng nguyên và kháng thể gặp nhau, phương pháp này thực hiện qua 2 giai đoạn. Giai đoạn 1, tách rời từng thành phần kháng nguyên trước bằng điện di. Giai đoạn 2, miễn dịch khuếch tán, đặt huyết thanh có chứa kháng thể vào rãnh dọc theo trục đi, kháng nguyên và kháng thể sẽ khuếch tán để gặp nhau và kết tủa. IV. Phản ứng kết hợp bổ thể Phản ứng kết hợp bổ thể thực hiện được nhờ 2 hệ thống: hệ thống dung khuẩn và hệ thống dung huyết với sự tham gia của bổ thể, bởi vì hiện tượng dung huyết không thể quan sát được bằng mắt thường, do đó phải dùng hệ thống dung huyết để đánh giá kết quả. Cho hệ thống dung khuẩn (hệ thống 1) vào ống nghiệm trước, gồm có kháng nguyên đã biết và huyết thanh con vật cần chẩn đoán đã đun lên 56° trong 30 phút để diệt bổ thể, sau đó cho tiếp vào ống nghiệm một lượng bổ thể đã được chuẩn độ vủa đủ lượng cần thiết (thường dùng huyết thanh tươi chuột lang) ủ ở 37°trong vòng 20-30 phút. 83 - Sau đó cho tiếp vào ống nghiệm hệ thống 2 (hệ thống dung huyết) gồm có hồng cầu và huyết thanh miễn dịch chống hồng cầu cừu đã được đun 56° trong 30 phút để diệt bổ thể, ủ tiếp cả 2 hệ thống ở 37° trong 20-30 phút rồi đọc kết quả. Nếu ở hệ thống 1 (hệ thống dung khuẩn), kháng nguyên và kháng thể tương ứng, thì sự kết hợp kháng nguyên kháng thể sẽ chiếm lấy bổ thể, không còn bổ thể cho hệ thống 2, nên không có sự dung huyết, hồng cầu đóng thành cục tròn đỏ dưới đáy ống nghiệm. Phản ứng dương tính, tức con vật có kháng thể tương ứng với kháng nguyên. - Nếu ở hệ thống 1 không có sự kết hợp kháng nguyên kháng thể do trong huyết thanh không có kháng thể tương ứng, thì bổ thể sẽ không được dùng cho hệ thống 1, bổ thể còn sẽ tham gia vào hệ thống 2 làm tan hồng cầu, tạo nên huyễn dịch có màu đỏ. Phản ứng âm tính, tức là trong huyết thanh không có kháng thể tương ứng. V. Phản ứng trung hòa 1. Phản ứng trung hòa độc tố Độc tố của vi khuẩn khi được vô độc bằng formol thì trở thành giải độc tố, không còn tính độc nhưng vẫn còn tính kháng nguyên cao, nên người ta thường dùng giải độc tố làm vắc xin, và khi tiêm cho cơ thể, chúng kích thích cơ thể sinh kháng thể rất tốt. Khi kháng thể đặc hiệu Hình 26. Nguyên lý của phản ứng kết hợp bổ thể (Theo Ian R. Tizard. 2004). Nếu bổ thể kết hợp với KN-KT sẽ không xảy ra hiện tượng tan hồng cầu. Nếu không có kháng thể để kết hợp thì bổ thể sẽ làm tan hồng cầu 84 này gặp độc tố tương ứng chúng sẽ kết hợp và làm cho độc tố đó không còn hoạt tính nữa hay còn gọi là độc tố đã bị trung hòa. Huyết thanh chứa kháng thể kháng độc tố được gọi là huyết thanh kháng độc tố và được sử dụng vào mục đích chữa bệnh. Khi tiêm huyết thanh kháng độc tố vào cơ thể, nếu gặp độc tố, chúng sẽ kết hợp và trung hòa độc tố đó, đây là phản ứng trung hòa trên cơ thể. Nếu cho kháng độc tố (kháng thể đặc hiệu chống độc tố) kết hợp với độc tố tương đương, thì phản ứng trung hòa sẽ xảy ra, nếu thực hiện in vitro trong ống nghiệm, sẽ thấy phức hợp miễn dịch này biểu hiện như những cụm bông lơ lửng, vì vậy người ta gọi là phản ứng lên bông. 2. Phản ứng trung hòa virus Khi virus bị kháng thể đặc hiệu kết hợp sẽ không còn khả năng gây bệnh nên phản ứng kết hợp giữa virus với kháng thể được gọi là phản ứng trung hòa virus. Người ta có thể dùng kháng huyết thanh liệu pháp (huyết thanh miễn dịch có chứa kháng thể đặc hiệu) để can thiệp vào ổ dịch do virus gây ra. Lúc này sự trung hòa virus xảy ra ngay sau khi tiêm huyết thanh miễn dịch vào cơ thể và con vật không còn bị virus gây bệnh được nữa. Với mục đích chẩn đoán virus trong phòng thí nghiệm in vitro, người ta có thể thực hiện phản ứng trung hòa virus trên phôi gà, trên động vật cảm thụ, và trên môi trường tế bào nuôi cấy. Nguyên lý cơ bản của phương pháp này: trên đối tượng nuôi cấy (phôi gà, động vật cảm thụ, môi trường tế bào) virus sẽ nhân lên và gây bệnh tích cho các đối tượng trên, còn khi hỗn hợp virus với kháng thể đặc hiệu tương ứng, chúng sẽ bị trung hòa, không nhân lên được và không gây bệnh tích. Nếu pha loãng virus (theo cơ số 10) rồi hỗn hợp với một lượng tương đương huyết thanh miễn dịch ở mỗi nồng độ, rồi thực hiện phản ứng trung hòa trên các đối tượng trên, người ta gọi đó là phản ứng trung 85 hòa theo phương pháp virus pha loãng, huyết thanh cố định. Bằng phản ứng này người ta chuẩn độ được virus. Nếu nồng độ virus cố định (thường dùng 100 đến 1000 liều ID50 hoặc LD50) và pha loãng huyết thanh theo cơ số 2: 1/2, 1/4, 1/8, 1/16.. và hỗn hợp như trên, rồi thực hiện phản ứng trung hòa người ta gọi đó là phản ứng trung hòa theo phương pháp virus cố định, huyết thanh pha loãng. Bằng phương pháp này người ta xác định được hiệu giá của huyết thanh trung hòa. Phản ứng trung hòa rất có ý nghĩa, người ta có thể sử dụng để định typ virus, định lượng kháng thể, chuẩn độ liều gây nhiễm hoặc liều gây chết 50% đối tượng thí nghiệm của một loại virus. VI. Các phản ứng sử dụng kháng thể đánh dấu Trong nhiều trường hợp để phát hiện phức hợp kháng nguyên- kháng thể cần phải sử dụng một số kỹ thuật mới nhìn thấy được. Người ta thường dùng những ký thuật sau đây: Phản ứng miễn dịch huỳnh quang: Dùng thuốc nhuộm huỳnh quang để nhuộm kháng thể rồi cho kết hợp với kháng nguyên (trực tiếp hoặc gián tiếp) và phát hiện phức hợp kháng nguyên-kháng thể bằng kính hiển vi huỳnh quang. Phản ứng miễn dịch đánh dấu enzym hay gọi là phản ứng ELISA. 1. Phản ứng miễn dịch huỳnh quang (Immuno-fluorescent test) Khi kháng thể hoặc kháng-kháng thể được nhuộm màu bằng thuốc nhuộm huỳnh quang (thường dùng Fluoescein isothiocyanat có màu xanh lục, rodamin có màu đỏ gạch) cho kết hợp với kháng nguyên, thì phức hợp kháng nguyên- kháng thể khi soi dưới kính hiển vi huỳnh quang sẽ phát sáng. Thuốc nhuộm huỳnh quang phải đạt các tiêu chuẩn: Không làm tổn thương tới tính sinh miễn dịch của kháng thể. Kết hợp với kháng thể một cách bền vững. Với một lượng ít nhưng có màu sắc rõ rệt 86 Thuốc dễ sử dụng và dế phân biệt với các mầu khác. 1.1. Phản ứng miễn dịch huỳnh quang trực tiếp Trong phản ứng này thường dùng kháng thể đặc hiệu nhuộm màu để phát hiện kháng nguyên chưa biết. Nguyên lý: Làm tiêu bản với bệnh phẩm cần chẩn đoán, cố định để kháng nguyên gắn chặt lên phiến kính, sau đó cho một giọt kháng thể đặc hiệu đã nhuộm huỳnh quang lên tiêu bản, để tác động một thời gian, sau đó rửa nước, để khô rồi quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang. Nếu có kết hợp kháng nguyên kháng thể thì sẽ thấy phát sáng Nếu kháng thể không tương ứng với kháng nguyên thì sẽ không có kết hợp kháng nguyên-kháng thể, khi rửa nước kháng thể bị trôi đi, do đó không thấy phát sáng. 1.2. Phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp. Có 3 thành phần tham gia phản ứng: kháng thể đặc hiệu, kháng-kháng thể đặc hiệu đã nhuộm huỳnh quang và kháng nguyên cần chẩn đoán. Như vậy kháng thể đăc hiệu ở đây có 2 chức năng: chức năng kháng thể đối với kháng nguyên cần chẩn đoán và chức năng là kháng nguyên đối với kháng kháng thể đã nhuộm màu. Phương pháp: Làm tiêu bản với bệnh phẩm cần chẩn đoán, cố định để kháng nguyên gắn chặt trên tiêu bản. Nhỏ một giọt kháng thể đặc hiệu lên bệnh phẩm cần chẩn đoán, để tác động 10-15 phút, rửa nước Nhỏ tiếp một giọt kháng kháng thể đã nhuộm huỳnh quang, để tác động một thời gian, rửa nước để khô, rồi quan sát đánh giá kết quả dưới kính hiển vi huỳnh quang. Nếu có phát sáng tức là có phức hợp kháng nguyên-kháng thể-kháng kháng thể, phản ứng dương tính, gia súc có mang mầm bệnh. 87 Nếu không có phát sáng, tức là không có phức hợp kháng nguyên-kháng thể-kháng kháng thể. Phản ứng âm tính, gia súc không mang mầm bệnh. 2. Phản ứng miễn dịch đánh dấu enzym (ELISA - Enzym - Linking - Immunosorbent Assay). Đây là một trong nhữnng phương pháp quan trọng được ứng dụng rộng rãi trong chẩn đoán thú y. 2.1. Phản ứng ELISA gián tiếp tìm kháng thể Nguyên lý: Các giếng của khay nhựa được phủ sẵn kháng nguyên. Kháng nguyên phải được gắn chặt vào khay nhựa sao cho sau khi rửa phải còn một lớp kháng nguyên phủ trong các giếng. Nhỏ huyết thanh (cần kiểm tra) vào các giếng, nếu trong huyếtt thanh có kháng thể đặc hiệu Hình 27. ELISA sandwich. Kháng nguyên được gắn vào khay nhựa bởi kháng thể. Sự có mặt của kháng nguyên được xác định bằng kháng thể thứ 2 và kháng - kháng thể đã gắn enzyme (Theo Ian R. Tizard. 2004) 88 thì kháng thể sẽ kết hợp với kháng nguyên được pha sẵn trong giếng. Sau khi ủ và rửa để loạii bỏ kháng thể không gắn với kháng nguyên, kháng thể đã kết hợp với kháng nguyên được phát hiện bởi kháng kháng thể đã được gắn enzyme, nhỏ cơ chất của enzyme làm đổi màu thành phần phản ứng. Độ đậm của màu sắc tỷ lệ với lượng kháng thể gắn enzyme được gắn với kháng thể có trong giếng, tức là tỷ lệ thuận với lượng kháng thể có trong huyết thanh. Kết quả của phản ứng được xác định bằng mắt thường hoặc bằng máy đo quang phổ. 2.2. Phản ứng ELISA trực tiếp tìm kháng nguyên Cố định kháng thể đặc hiệu vào các giếng của khay nhựa, rửa nước để loại bỏ kháng thể không gắn. Cho huyết thanh hoặc huyễn dịch bệnh phẩm (nghi có chứa kháng nguyên) đã chiết xuất thành dung dịch vào. Nếu có kháng nguyên tương ứng chúng sẽ gắn với kháng thể đặc hiệu. Rửa nước để loại bỏ các thành phần thừa. Cho kháng kháng thể đã gắn enzym vào. Kháng kháng thể sẽ gắn với kháng nguyên trong phức hợp kháng nguyên-kháng thể ở bước trên. Rửa nước để loại bỏ các thành phần thừa của phản ứng. Sau khi cho cơ chất của enzym vào, nếu có xuất hiện màu tức là có kháng nguyên tương ứng vớii kháng thể đặc hiệu, phản ứng dương tính. Nếu không xuất hiện màu, tức là không có kháng nguyên tương ứng với kháng thể nên không có kết hợp kháng nguyên-kháng thể và kháng nguyên và kháng kháng thể bị rửa trôi. Phản ứng âm tính. Phản ứng này tạo ra tập hợp kháng thể-kháng nguyên-kháng thể nên còn được gọi là phản ứng ELISA sandwich. Phản ứng này được sử dụng rộng rãi, đặc biệt trong trường hợp lượng kháng nguyên quá ít không đủ để phát hiện bằng phương pháp trực tiếp. 89 Hình 28. ELISA gián tiếp. Kháng nguyên được gắn trực tiếp vào khay. Sự có mặt của kháng thể sẽ được xác định bằng kháng kháng thể đã gắn enzyme. Sau khi thêm cơ chất phản ứng màu sẽ xuất hiện tỷ lệ thuận với lượng kháng thể có trong huyết thanh (Theo Ian R. Tizard. 2004) Hình 29. ELSA đánh dấu kháng nguyên. Huyết thanh phản ứng được cho vào khay đã được phủ kháng nguyên. Sau đó được phát triển bởi kháng huyết thanh đã đánh dấu có gắn enzyme (Theo Ian R. Tizard. 2004) 90 3. Phương pháp Immunoperoxidase Enzyme đã được gắn vào kháng thể hoặc kháng kháng thể được sử dụng để phát hiện kháng nguyên có trong mô bào. Horseradish peroxidase là enzyme được sử dụng rộng rãi nhất. Có phương pháp trực tiếp và gián tiếp. Phương pháp trực tiếp: Tiêu bản mô bào được xử lý bởi kháng thể gắn enzyme. Sau khi rửa, tiêu bản được ủ với cơ chất enzyme thích hợp. Kháng thể được phát hiện nhờ có sự xuất hiện màu khi có kết hợp kháng nguyên-kháng thể. Phương pháp gián tiếp: Trong phản ứng này kháng thể được phát hiện nhờ kháng kháng thể được gắn enzyme. 4. Phương pháp Western Blotting Đây là một phương pháp để xác định kháng nguyên trong một hỗn hợp nhiều loại kháng nguyên. Phương pháp này gồm 3 bước chính: Bước 1 là bước điện di trong gel để tách các loại protein riêng biệtt. Bước 2: Chuyển các protein lên giấy thấm. Bước 3 là phát hiện kháng nguyên bằng phản ứng miễn dịch enzyme: Màng được ủ trong huyết thanh có chưa kháng thể nguyên. Sau khi rửa, kháng kháng thể gắn enzyme được bổ sung vào và màu sẽ xuất hiện (tại những dải có chứa kháng nguyên tương ứng với kháng thể) sau khi được gặp cơ chất enzyme thích hợp.