Định lượng E.coli giả định bằng phương pháp mpn

ĐỊNH LƯỢNG E.COLI GIẢ ĐỊNHBẰNG PHƯƠNG PHÁP MPNPhạm Thị Vinh HoaPhòng Xét nghiệm trung tâm- Indicators of microbial water quality: General (process) microbial indicatorsFaecal indicators (such as E. coli)Index organisms and model organisms.US Environmental Protection Agency The EPA has determined that E. coli are one of the best indicators for the presence of potentially pathogenic bacteria. Because E. coli monitoring does not measure the actual pathogens, the assessment is not foolproof, however, it is a good approach for assessing the likelihood of risks to human health. Monitoring for these indicator organisms is an easy and economical method for citizens or professionals to assess health risks due to bacterial contamination of surface waters. coli (E. coli): Thermophilic coliforms that produce indole from tryptophan, but also defined now as coliforms able to produce β-glucuronidase (although taxonomically up to 10% of environmental E. coli may not). Most appropriate group of coliforms to indicate faecal pollution from warm-blooded animals.ẠI SAO CẦN KIỂM TRA ESCHERICHIA COLI?ESCHERICHIA COLIình que, Gram-âm, không sinh bào tử Lên men đường lactose sinh hơi và acid ở 44oCSự có mặt của E.coli khẳng định sự nhiễm khuẩn từ phânTÀI LIỆU THAM KHẢOTCVN 5999:1995 (ISO 5667/10:1992): Chất lượng nước. Lấy mẫu. Hướng dẫn lấy mẫu nước thảiTCVN 8880:2011 (ISO 19458:2006): Chất lượng nước. Lấy mẫu để phân tích vi sinh vậtTCVN 6187-2:1996 (ISO 9308/2:1990): Chất lượng nước. Phát hiện và đếm vi khuẩn coliform, vi khuẩn coliform chịu nhiệt và escherichia coli giả định. Phần 2: Phương pháp nhiều ống (số có xác suất cao nhất)MỤC TIÊU HỌC TẬPSau khi học, học viên có khả năng:Trình bày được nguyên lý của phương pháp MPNTrình bày được phạm vi áp dụng, nguyên tắc và các bước tiến hành định lượng E.coli giả định trong môi trường nước bằng phương pháp MPN.Nhận định được kết quảNỘI DUNG BÀI GIẢNG1. Phạm vi áp dụng & nguyên lý2. Phương pháp MPN3. Chuẩn bị thí nghiệm4. Các bước tiến hành5. Đọc kết quảPhạm vi áp dụng Đếm số lượng coliform, coliform chịu nhiệt, và E.coli giả định trong mọi loại nước, kể cả nước có vật chất lơ lửng.Nguyên lýE.coli: Định lượng vi sinh vật lên men lactose sinh khí và tạo thành Indol từ tryptophan khi nuôi cấy trong canh thang tăng sinh chọn lọc ở 44oC bằng phương pháp tính số có xác suất lớn nhất (Most Probable number -MPN)PHẠM VI ÁP DỤNG & NGUYÊN LÝPHƯƠNG PHÁP MPNnồng độ 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 độ pha loãng 101 102 103 104 105 106 107 Nồng độ và độ pha loãng mẫuPHƯƠNG PHÁP MPNXác suất thống kê sự phân bố VSV trong các độ pha loãng khác nhau của mẫuMỗi độ pha loãng được lặp lại nhiều lần (3 lần)Các độ pha loãng được chọn lựa sao cho trong các lần lặp lại có một số lần dương tính và âm tínhSố lần dương tính được ghi nhận và so sánh với bảng thống kê  giá trị ước đoán số lượng VSV trong mẫuNguyên tắc:Hai hệ thống MPN: Hệ thống 9 ống Hệ thống 15 ốngPHƯƠNG PHÁP MPNĐặc điểm:VSV mục tiêu phải có những biểu hiện đặc trưng trên môi trường nuôi cấy: sinh hơi, đổi màu môi trường... Cho phép định lượng được mật độ VSV thấp trong thể tích mẫu lớnPHƯƠNG PHÁP MPNHệ thống 9 ốngHệ thống 15 ống10 ml môi trườngPHƯƠNG PHÁP MPN1. Chuẩn bị các ống nghiệm có chứa môi trường thích hợp cho sự tăng trưởng của đối tượng VSV cần định lượngCác bước tiến hànhPHƯƠNG PHÁP MPN2. Cấy một thể tích chính xác dung dịch mẫu ở 3 nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếpCác bước tiến hànhPHƯƠNG PHÁP MPN3. Đem ống nghiệm ủ ở điều kiện thích hợpCác bước tiến hànhPHƯƠNG PHÁP MPN4. Quan sát các biểu hiện chứng minh sự phát triển của VSV cần kiểm địnhSự đổi màu của môi trườngCác bước tiến hànhPHƯƠNG PHÁP MPN5. Ghi nhận số ống dương tính ở từng độ pha loãngCác bước tiến hànhPHƯƠNG PHÁP MPN6. Tra bảng Mac Crady để suy ra mật độ VSVTra bảngMPN/100mlKết quả101102103Các bước tiến hànhPHƯƠNG PHÁP MPNThứ tự ưu tiên chọn từ 1  41. Chọn nồng độ thấp nhất có tất cả ống (+)  chọn 2 nồng độ nhỏ hơn để tính. Ví dụ 1 nếu có nhiều hơn 1 trong 3 nồng độ được chọn này không có ống (+)  chọn nồng độ lớn nhất không có ống (+) và 2 nồng độ lớn hơn để tính. Ví dụ 4, 52. Nếu các nồng độ nhỏ hơn nồng độ lớn nhất có tất cả các ống (+)  chọn 3 nồng độ mẫu nhỏ nhất trong cả dãy. Ví dụ 23. Chọn 3 nồng độ thấp nhất trong cả dãy, trong đó có ít nhất 1 ống (+). Ví dụ 34. Chỉ nồng độ đầu tiền có ống (+)  chọn thêm 2 nồng độ pha loãng tiếp theo để tính ngay cả khi 2 nồng độ này không có ống (+) nào. Ví dụ 6, 7MẫuSố ống (+)13 3 2 1 023 3 3 3 032 2 1 1 043 3 0 0 052 2 0 1 0 63 0 0 0 072 0 0 0 0____ tổ hợp được chọnLựa chọn các độ pha loãng để tính kết quảKết quả: Số VSV (MPN/ml) = kết quả tra bảng x (f/10) Trong đó: f: độ pha loãng thấp nhất được chọn (10n)Biểu thị kết quả dưới dạng thập phân giữa 1,0 và 9,9 nhân với 10n (n là số mũ thích hợp của 10)Ví dụ: PHƯƠNG PHÁP MPN103104105201Kết quả:14x103/10=1,4x103 (MPN/ml)Tra bảngPHƯƠNG PHÁP MPN6. Tra bảng Mac Crady để suy ra mật độ VSVTra bảngMPN/100mlKết quả70x101/10=7,0x101 (MPN/ml)101102103PHƯƠNG PHÁP MPNSố VSV = 7,0x101 MPN/mlHệ thống 15 ốngPHƯƠNG PHÁP MPN321Kết quả?102103104Hệ thống 9 ốngPeptone water FlaskPipette Dụng cụ, Môi trường phải được khử trùng Môi trường phải được kiểm chứngLTS brothCHUẨN BỊ THÍ NGHIỆMEC brothThuốc thử Indol (Kovacs)Chủng chuẩn+ Chứng âm: Salmonella typhimurium ATCC 14028+ Chứng dương: Escherichia coli ATCC 25922Bước 1: Chuẩn bị mẫu Lấy 100ml mẫu nước bề mặt vào bình tam giác  nồng độ 10o CÁC BƯỚC TIẾN HÀNHBước 2: Pha loãng mẫu Hút 1ml mẫu + 9ml MT peptone trong ống nghiệm  nồng độ 10-1. Pha loãng tiếp tục để được các nồng độ 10-2 và 10-3 Bước 3: Nuôi cấy trên môi trường tăng sinh/chọn lọc 1 Nồng độ đơn: Hút 1ml mẫu pha loãng + 10ml MT Tryptose Lauryl Sunfat trong ống nghiệm  nuôi cấy ở 37±1oC/24-48h. Nồng độ kép: Hút 10ml mẫu pha loãng + 10ml MT Tryptose Lauryl Sunfat trong ống nghiệm  nuôi cấy ở 37±1oC/24-48h. kết quả (+): sử dụng lactose sinh khíBước 4: Nuôi cấy trên môi trường chọn lọc 2 Cấy chuyển từ MT LTS (+) sang MT EC broth  nuôi cấy ở 44oC/48hCÁC BƯỚC TIẾN HÀNHBước 5: Thử sinh hóa khẳng định cho E.coli Cấy chuyển từ MT EC broth (+) sang MT trypton  nuôi cấy ở 44oC/48h  nhỏ 0.5ml dd Kovacs vào ống nuôi cấy kết quả (+): sử dụng lactose sinh khí kết quả (+): tạo vòng Indol màu đỏThử nghiệm khả năng sinh IndolMục đíchPhát hiện các VSV có khả năng sinh indol  các VSV có hệ emzym tryptophanaseChủng VSVMT canh tryptonThuốc thử Kovac’sPứ dương tínhPứ âm tính44oC / 24hCÁC BƯỚC TIẾN HÀNHSơ đồ các bước định lượng E.coli giả địnhĐỌC KẾT QUẢ(+)(-)(-)(+)Coliforms/E.coli trong MT LTS ĐỌC KẾT QUẢE.coli trong MT ECE.coli sinh Indol(+)(-)Nhiệm vụ của nhóm1. Nhóm 1 đến 5: mẫu MT PD05 Nhóm 1: 10-1, 10-2, 10-3 Nhóm 2: 10-2, 10-3, 10-4 Nhóm 3: 10-3, 10-4, 10-5 Nhóm 4: 10-4, 10-5, 10-6 Nhóm 5: 10-5, 10-6, 10-72. Nhóm 6 đến 10: mẫu MT HSPH Nhóm 6: 10-1, 10-2, 10-3 Nhóm 7: 10-2, 10-3, 10-4 Nhóm 8: 10-3, 10-4, 10-5 Nhóm 9: 10-4, 10-5, 10-6 Nhóm 10: 10-5, 10-6, 10-73. Nhóm 11: mẫu chứng âm, dương Chứng âm: Salmonella Chứng dương: E.coli