Sinh học - Microarray

MICROARRAY NGUYEN THAI THUY, MSc NATIONAL SALES MANAGER BIO-RAD LABORATORIES NỘI DUNG Lịch sử phát triển Microarray Hệ thống thiết bị NỘI DUNG Lịch sử phát triển Microarray Hệ thống thiết bị LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN  1953 Watson & Crick: mô hình cấu trúc DNA  1975 Phát triển bởi Edwin Southern: ‚Southern Blot‛ ” DNA cố định được probe bằng cDNA đánh dấu ” Được xem là macroarray trên màng  Màng Nylon Tối đa 60 spots / cm 2 “ 5 - 10 ml dung dịch lai “ Có thể sử dụng lại tối đa 8 lần “ Độ phân giải: 20 -100 µm “ Tín hiệu nền cao LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN  Slide kính 2,500 - 10,000 spots / cm 2 10 - 20 µl Tái sử dụng tùy theo đặc tính của slide Độ phân giải cao: 5 -10 µm Tín hiệu nền thấp LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN  Càng nhỏ càng tốt !!  Lượng mẫu càng ít càng tốt  Nhiều cơ hội thí nghiệm  Nhiều thông tin nhận được trong một kích thước giới hạn LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN  Microarray phát triển theo hai hứơng:  Steven Fodor; Affymetrix  Affychips  Pat Brown et al; Stanford University  Synteni/Standford chips LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN Affymetrix  DNA oligos được tổng hợp trược tiếp thành array trên slide  Ưu:  Chính xác với trình tự đã biết  Khuyết:  Giới hạn kích thước trình tự tổng hợp (ngắn)  Ít sử dụng LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN Brown  ‘In’ các đọan DNA hiện diện sẵn lên bề mặt slide tạo array  Khuếch đại đọan DNA (clone set) nhờ PCR, tinh sạch mẫu, trộn với buffer  Mẫu được ‘in’ bằng hệ thống robot LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN Brown  Ưu  Hiệu quả kinh tế  oligos + cDNA  Hệ thống mở, phổ biến  Khuyết  Cấu trúc bề mặt  Người sử dụng phải tự độc lập về kỹ thuật  Không dễ có kết quả LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN  1995 - microarray phát triển cho phân tích biểu hiện gene  2003 - dự án human genome hòan tất, 1 slide cần > 120,000 spot, tuy nhiên các slide hiện tại giới hạn trong vòng 80,000 spot  In trên 2 slides  Spots nhỏ hơn (70/80 um so với hiện tại 100um). Scanner độ phân giải cao hơn (< 3um) LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 Microarray OR Microarrays 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 N u m b e r o f P a p e rs Year Microarray Publications Số lượng các công bố ứng dụng microarray tăng nhanh NỘI DUNG Lịch sử phát triển Microarray Hệ thống thiết bị Microarrays là tấm kính hoặc silicon, hay màng nylon mang matrix 2 chiều của các gene. Các gene được cố định trên bề mặt bằng phương tiện tự động. Sau khi cố định, các gene được probe bằng các probe hùynh quang. Bằng cách định lượng mật độ hùynh quang của các spot trong matrix, chúng ta có được tòan cảnh mức độ họat động của gene và các tương quan giữa các gene trong các điều kiện nhất định. Microarray là gì? Definitions Ưu điểm của Microarray  Nghiên cứu phiên mã của hàng ngàn gene cùng lúc - Xác định chức năng của các gene mới - Xác định chức năng của các gene đã biết - Xác định pathways của tương tác gene  Thuận tiện cho các ứng dụng ‘high throughput screening’: - Phát hiện SNP, screening kháng nguyên , Proteomic Thuật ngữ “ Substrate: Bề mặt phẳng nơi in microarray, thường là kính đã qua xử lý hóa chất để tăng độ bám. “ Array elements: DNA, protein hoặc các vật liệu khác để in (spot) lên microarray substrate. “ Probe: phân tử được đánh dấu hùynh quang hay còn gọi là ‘Target’. “ Hybridization phản ứng giữa probe và các microarray element. SubstrateArray Elements Probes Lai probes với array elements ĐKTN 1. ĐKTN 2. Array element đa dạng phụ thuộc ứng dụng “ Biểu hiện gene (DNA) “ Phát hiện SNP (oligos ngắn) “ Chẩn đóan & sàng lọc (DNA, proteins, kháng thể, kháng nguyên) Probes được tạo theo từng điều kiện thí nghiệm riêng biệt Tế bào/mô control Tế bào/mô thí nghiệm Control Mẫu Quy Trình DNA Microarray Phân tích dữ liệu Tổng hợp Probe Lai Microarray Scan biểu hiện Tạo microarray Thực hiện thí nghiệm Ví dụ minh họa Ứng Dụng Của Microarray “ Genomics “ Phân tích biểu hiện gene “ Phân tích SNP “ Proteomics “ Nghiên cứu dược “ Chẩn đóan y khoa “ Gene Expression Profiling (GEP) ” Khám phá gene ” Bệnh học nhiễm trùng ” pharmacogenomics “ Genotyping: SNP detection ” Phân tích đột biến ” pharmacogenomics DNA RNA Ứng Dụng Của Microarray Các Bước Thực Hiện Thí Nghiệm Microarray  Tạo Slide “ Chuẩn bị DNA vào các plate nguồn “ Chuẩn bị vàspotting slide  Thiết kế thí nghiệm  Chuẩn bị DNA mẫu  Đánh dấu DNA mẫu Microarray Protocol & kết quả  Lai  Scan  Phân tích dữ liệu Microarray Protocol Chuẩn Bị Array  Có thể array 2 dạng DNA:  cDNA  oligos  Oligos: đọan DNA ngắn tổng hợp  cDNA được tạo thành từ nhân bản plasmid DNA  ‚libraries‛ Chuẩn Bị Đĩa Nguồn cDNAs  Lấy tòan bộ mRNA từ single cell type  reverse transcribe tòan bộ mRNA thành cDNA  Chèn cDNA’s vào plasmid  Chuyển vào tế bào vi khuẩn (E. coli)  Tạo cDNA library cho cell type này Chọn Lọc Khuẩn Lạc Tế bào vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc Hai qui trình sàng lọc giúp phân lập khuẩn lạc chứa cDNA mà nhà nghiên cứu quan tâm Tế bào vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc Hai qui trình sàng lọc giúp phân lập khuẩn lạc chứa cDNA mà nhà nghiên cứu quan tâm  Plasmid chứa gene kháng kháng sinh  Sau chuyển gene, tế bào vi khuẩn được xử lý bằng kháng sinh  Chỉ có những tế bào nào đã nhận được plasmid phát triển  Plasmid thông dụng mang gene lacZ, khi biểu hiện làm tế bào vi khuẩn có màu xanh  cDNAquan tâm chèn vào giữa lacZ gene.  Kết quả là lacZ không được tạo thành, tế bào có màu trắng. Chọn Lọc Khuẩn Lạc Lấy Khuẩn Lạc Lấy khuẩn lạc tái tổ hợp màu trắng và cho vào đĩa 96 hay 384 giếng. Đĩa có thể trữ ở -80ºC như một thư viện 1000 cDNA’s (1 khuẩn lạc = 1 cDNA) có thể biểu hiện ở cell type này Tạo Spot DNA Từ Đĩa Nguồn  Chuyển một lượng nhỏ khuẩn lạc từ đĩa nguồn vào đĩa 96 hay 384 giếng mới  Tinh sạch DNA  PCR Ploymerase Chain Reaction (PCR) “ Nhân cDNA plasmid trong giếng bằng universal oligo primers “ (có gắn nhóm phù hợp (vd. amino) để bám lên bề mặt slide) cDNA Plasmid oligo primer oligo primer với nhóm gắn Tạo Array “ Tinh sạch sản phẩm PCR products “ Cho sản phẩm PCR vào microspotting buffer “ Spot lên slide từ đĩa 96 hoặc 384 giếng bằng ChipWriter Microarray Slide “ Các slide có phủ hóa chất để DNA bám vào dễ dàng ” aldehyde, silane ” amine, poly L-lysine “ Các Cty sản xuất slide ” CMT-GAP™ (Corning) ” FAST slides (S&S) ” SuperAmine™, SuperAldehyde™ (Telechem) ” DNA Ready Type I & Type II (Clonetech) Bảo Quản Slide  Làm khô slide  Rửa các DNA không bám và muối  Làm khô  Trữ trong TỐI và KHÔ ( 6 tháng) Quy Trình Dùng cDNA Libraries mRNA cDNA Gắn cDNA lên Vector Chuyển vào vi khuẩn Phát triển khuẩn lạc Lấy khuẩn lạc Tinh sạch Plasmid DNA PCR Tinh sạch sản phẩmPCR Spot Array THÍ NGHIỆM NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GENE Ly trích RNA Từ mẫu thí nghiệm Control Mẫu Đánh dấu RNA Probe Lai với array Control Scan Array Phân tích/ định lượng biểu hiện Thí Nghiệm Biểu Hiện Gene Điển Hình Real-time PCR Xác định/ định lượng Mẫu Đánh Dấu Probe “ Reverse transcribe mRNA từ 2 nguồn cDNA  A,T,G,C Đánh dấu hùynh quang dUTP hay dCTP  Kit thương mại: Amersham hay Molecular Probes Cy3 - control và Cy5 - mẫu Control Controlmẫu mẫu Lai “ Trộn các cDNA probe đánh dấu bằng Cy 3, Cy 5 với nhau sau đó cho lên microarray “ Thông số lai ” Thể tích 25 - 300 l ” Thời gian 6 - 24 hours ” Nhiệt độ 42 - 65 C ” Buffer muối (SSC) saline sodium citrate “ Rửa sạch các DNA không bám Scanning Biểu Hiện Gene Mẫu biểu hiện mạnh hơn Control biểu hiện mạnh hơn Biểu hiện tương đồng giữa mẫu &control Biểu hiện kém Tỷ Lệ Green/Red Ratio Genes that are down-regulated sample:control Genes that are up- regulated sample: control 1:1 Ratio Bước Tiếp Theo... “ Xác định gene ở vị trí spots quan tâm “ Từ đó hiểu được gene đó có chức năng và/ hoặc cơ chế phân tử của họat động đáp ứng điều kiện thí nghiệm. Thí Nghiệm Genotyping Sàng lọc số lượng mẫu nhiều cho các SNP đã biết Xác Định SNP  Thường dùng trong sàng lọc di truyền, chẩn đóan  Hai dạng chính Một bệnh nhân/ mẫu - oligos đại diện cho các gene khác nhau arrayed lên chip - Một mẫu được đánh dấu và lai lên chip - Xác định genotype theo kết quả lai - Đắt tiền  Nhiều bệnh nhân /mẫu - cDNA mẫu từ nhiều thí nghiệm /bệnh nhân arrayed lên chip - Chỉ tạo array một vài loci quan tâm - probe là oligo đánh dấu bổ sung cho gene loci quan tâm - Xác định genotype theo oligos bám lên array mẫu với hiệu quả khác nhau tùy theo trình tự mẫu - Tốn thời gian Chuẩn Bị DNA Từ Nhiều Mẫu “ Tinh sạch genomic DNA từ nhiều mẫu “ PCR primers đặc hiệu cho gene “ Tinh sạch sản phẩm PCR “ spot lên slide Mỗi đối tượng mẫu = 1 Spot trên Array     Mẫu máu Ly trích DNA PCR vùng gene đã biết SNP Spot sản phẩm PCR Probe cho SNP đặc hiệu đã biết “ Thiết kế 15 base oligomer mang vị trí polymorphic 8, đánh dấu hùynh quang bằng dCTP hay dUTP TCT CTG GGT CTG AGG * “ gai của hoa hồng Proteomics Cấu trúc của alcohol dehydrogenase Protein Arrays  Ngày một phổ biến  Khảo sát - Tương tác protein-protein - protein tương tác thuốc” khám phá thuốc - Biến đổi sau dịch mã Protein Microarrays • Protein chips • Yeast 2 Hybrid arrays Protein Arrays (CH2)4 NH3 O CH2 CH Expoxide substrate Protein (CH2)4 H-NH CH2 HO-CH Surface Coupling Protein Arrays (CH2)4 H-NH CH2 HO-CH Yeast 2 Hybrid  Có thể chứng minh tương tác protein - protein mà không cần ly trích và tinh sạch proteins. A rray khuẩn lạc yeast sống Đòi hỏi robotic arrayer công suất lớn Yeast 2 Hybrid DNA Binding (A) Transcription Activation (B) mRNA transcription Của reporter gene Gene promoter region “Wild Type” Kết quả: tế bào sống Transcription factor Yeast 2 Hybrid Bait Protein (X) DNA Binding (A) Prey Protein (Y) Transcription Activation (B) “Bait -&- Prey”: Viable Yeast 2 Hybrid Mating Yeast 2 Hybrid Gene promoter mRNA transcription of reporter gene Bait Protein (X) DNA Binding (A) Prey Protein (Y) Transcription Activation (B) Kết quả: tế bào sống Chứng tỏ tương tác proteins ‚X‛ & ‚Y‛ Sau khi Mating Yeast 2 Hybrid Prey Protein (Z) Transcription Activation (B) Bait Protein (X) DNA Binding (A) “Bait -&- Prey”: hủy diệt Yeast 2 Hybrid Sau khi Mating Yeast 2 Hybrid Gene promoter Bait Protein (X) DNA Binding (A) Kết quả: tế bào chết mRNA transcription of reporter gene X Prey Protein (Z) Transcription Activation (B) Chứng tỏ proteins ‚X‛ & ‚Z‛ Không tương tác Sau khi Mating Yeast 2 Hybrid “Wild Type” “Bait-&-Prey” Hầu hết các khuẩn lạc sống = khuẩn lạc sống NỘI DUNG Lịch sử phát triển Microarray Hệ thống thiết bị “ Thứ sáu ngày 13 DNA Microarray Workflow Phân tích số liệu Đánh dấu probes bằng Cy3 & CY5 Lai microarrayScan kết quả lai Tạo microarray slides • VersArray Hybridization Chamber •BioOdyssey Calligrapher MiniArrayer • VersArray ChipReader Xác định lại bằng qRT- PCR Ly trích RNA •Aurum Total RNA Kits •Experion:automatic electrophoresis •SmartSpec Plus: Spectrophotometer •VersaFluor: Fluorometer Phân tích RNA (chất lượng và hiệu suất ly trích) •GeneGazer Software •VersArray analyzer 5.0 Control cells/tissu e Experimental cells/tissue Bio-Plex Suspension Array System Molecular Imager FX Pro Plus MultiImager System RTPCR Instruments & Consumables: Validation Experion HTP Electrophoresis: RNA QC, protein analysis Aurum Total RNA kits Arrayers Tự Động • PCR products • Oligos • Antibodies • Proteins • Other biomolecules Micron sized spots of: Phân lọai Arrayer Không tiếp xúc “piezoelectric “ink-jet pin technology: quill, solid, pin-and-ring Tiếp xúc “pin technology So Sánh Các Arrayer Không TXúc Tiếp Xúc Tổng hợp oligo  trên chip Tổng hợp sẵn oligo   Đọan gene  Genes  Proteins  Các điểm lưu ý . Vận hành tối đa 32 plate - Dạng 96 hay 384 giếng, - Có hoặc không có nắp đậy - bar code để quản lý mẫu - Phần mềm quản lý truy xuất hòan chỉnh . Tạo dòng và hàng thẳng, chính xác . In > 81,000 spots trên slide . Chính xác đến 10 um từ spot đầu tiên đến spot cuối cùng . Chức năng robotic: Digital motor, tự xác định chính xác vị trí và thời điểm in - Có thể in trên nhiều lọai substrates, slide hình dạng khác nhau, membrane - Lập trình hòan chỉnh: cách và thời gian rửa pin, pre- blotting, tiếp xúc của pin chứa mẫu lên subtrate, số lần in mẫu lại - Phân phối dung dịch - Lấy và in microarray các khuẩn lạc . Mã nguồn robot mỡ cho phép tối ưu hóa họat động của robot “ Không đồng đều: kích thước, hình dạng, mật đo Tốn thời gian phân tích Dữ liệu không chính xác “ Các hàng, cột không thẳnng Array Chất Lượng Kém Array chất lượng kém = Array chất lượng tốt Đồng nhất = dữ liệu chính xác TeleChem Stealth Pins -Dạng ‚quill‛ dùng cho in lên slide - Dạng ‚solid‛ dùng cho các lọai membrane Xác định lượng mẫu Mẫu ở đầu cuối của tip Substrate lấy giọt mẫu đi, không tiếp xúc in TeleChem Pins Spot #1 Spot # 200 Trên 200 spots đồng đều / nạp pin fall Microarray Scanners  Bước sóng đôi (Cy3/Cy5), confocal laser scanner  Simultaneous-Sequential Scanning  PMT đôi/ độc lập  Độ phân gỉai cao: 5 um, 3 um  Nhỏ gọn Màu hùynh quang tương thích Cy3 and Cy5 are trademarks of Amersham Pharmacia Biotech Inc. BODIPY and Alexa are trademarks of Molecular Probes Inc. Tương thích Cy5 •Cy5.5 •Bodipy 630/650 650/665 • Alexa 633,647, 660,680 TM Tương thích Cy3 “Cy3.5 “Bodipy TMR “ Alexa 532,546, 555,568 “ Tetramethyl- rhodamine “POPO-3, PO-PRO-3 TM Non Confocal Optics slide detector Unwanted rays of light are detected Autofluorescence from deep below glass surface is detected infinite depth of focus slide detector pin-hole Bio-Rad Confocal Optics Other rays of light blocked by pin-hole Autofluorescence from deep below glass surface is greatly attenuated Stray light greatly attenuated 25 micron depth - Cải thiện tỷ lệ tín hiệu/nhiễu - Giảm tín hiệu nền - Tăng dynamic range Simultaneous-Sequential Scanning Laser 1 Laser 2 Detector 1 Detector 2 Laser 1 from Media Cybernetics image files Laser 2 Slide di chuyển trục ‚y‛ Detector 1 Detector 2 Laser 1 from Media Cybernetics image files Laser 2 Detector 1 Detector 2 Tránh bảo hòa tín hiệu mạnh Phân tích hình ảnh real-time - Chọn thông số tối ưu để phân tích - Scan lần 1 rồi tối ưu hóa thông số - Kiểm tra dynamic range - Scan lần hai thu dữ liệu chính xác Adaptable Dynamic Range Technology Gỉam thiểu scan thăm dò = giảm mất màu = dữ liệu chính xác Spot 1 SNR 43Spot 2 SNR 34 Spot 3 SNR 27Spot 4 SNR 21Spot 5 SNR 10 Spot 6 SNR 9 Spot 7 SNR 6 Spot 8 SNR 5 Spot 9 SNR 4 Spot 10 SNR 4 Saturation Invalid Data Noise Level Valid Data Ideal Slope Dynamic Range Tín hiệu ghi nhận có thể tốt, nhưng không thực sự phản ánh mức độ biểu hiện Valid Data Invalid Data Noise Level Ideal Slope Spot 1 SNR 99Spot 2 SNR 66 Spot 3 SNR 36Spot 4 SNR 18Spot 5 SNR 10 Spot 6 SNR 5Spot 7 SNR 3Spot 8 SNR 3Spot 9 SNR 2 Spot 10 SNR 2 ADR software technology, có dynamic range rộng = dữ liệu chính xác “ Phần mềm tòan diện cho phép phân tích thống kê các hình ảnh từ các slide “ Tự động xác định spot và grid Linh động cho phép người sữ dụng kiểm sóat mọi cấp phân tích Kết nối Genebank, NCBI “ Xuất ra file Excel thông dụng Phân tích dữ liệu VersArray Phần mềm phân tích dữ liệu VersArray Genes down- regulated sample:control Genes up- regulated sample: control Hình ảnh từ Scanner Control cells/tissue Experimental cells/tissue 1 Image for each sample 2 images/slide False color overlay Số hóa Average Pixel intensity/spot Background Name ch1 Signal ch1 Bkg ch2 Signal ch2 Bkg aAmyl2B 1028 473 1298 528 ABC 2924 215 15307 684 AcSphingo 732 310 52319 472 ADTB1 873 427 1036 598 BMP1 660 274 1242 498 ENO2 3321 438 1589 384 CathS 15337 322 27809 554 hsBUB1 10188 291 12329 378 GADD45 31021 572 36792 605 ZN15 3399 326 3748 498 Đồ thị S i g n a l 0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000 gene 1 gene 2 gene 3 gene 4 Control Experimental Phân tích thay đổi theo thời gian Develop patterns of gene expression over time -1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 time 0 time 1 time 2 time 3 time 4 time 5 Gene 1 Gene 2 Gene 3 L o g 2 E x p e ri m e n ta l/ N o rm a l 0 1 2 4 8 12 24 Quá tải dữ liệu! Transcription profiles of 1800 genes over 7 time points from PMA stimulated HeLa cells Microarray Analysis Generates Large Amounts of Data Database capabilities Bioinformatics Programs Statistical resources 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 -4 -2 0 2 4 simplify analysis .Further statistical analysis to define genes of interest Phân tích dữ liệu theo nhóm ” cluster analysis QÚA PHỨC TẠP DNA Microarray tóm tắt quy trình “Tạo microarray “Thực hiện thí nghiệm “Tổng hợp probe “Lai microarray “Scan microarray “Phân tích dữ liệu Array element? Đặc tính hóa học bề mặt slide Bố trí array Chọn phương pháp so sánh phù hợp Probe đánh dấu? Thực hiện protocol phù hợp Scan dữ liệu Dãy tuyến tính? signal:noise? khả năng mất màu? Chọn phương pháp phân tích Tham khảo • BioTechniques, Vol. 29, No. 3, p 548 (2000) • Microarray Biochip Technology, Mark Schena (ed.), BioTechniques Books, Eaton Publishing (2000) • www.gene-chips.com • Heng Zhu et. al., Global analysis of Protein Activities Using Proteome Chips, Science Express (Online), July 26, 2001 Website “ GRID IT - www.bsi.vt.edu/ralscher/gridit “ Science Magazine - www.sciencegenomics.org “ Nature Genome Site - www.nature.com/genomics/ “ DNA Microarray - www.gene-chips.com/ “ Institute for Genomic Research - www.tigr.org/tdb/microarray/ 2008 Dr. Francis Crick dances with his daughter at the 1962 Nobel Awards banquet.